顯微課堂 | 利用快速高對比度成像改進斑馬魚-胚胎篩查

利用先進的成像技術提高

斑馬魚胚胎分析的清晰度和速度

本文介紹了帶有THUNDER功能的 DM6 B 顯微鏡如何簡化轉基因斑馬魚胚胎的篩選，解決傳統顯微鏡分辨率低和焦外模糊的常見問題。高速成像、增強的對比度以及對低蛋白表達成像的靈敏度，確保了準確高效的篩選。其主要功能包括即時計算清除、高靈敏度攝像頭和定向照明，是發育生物學的理想之選。

篩選轉基因斑馬魚胚胎

轉基因斑馬魚胚胎是發育生物學中常用的模式生物 [1]。這些樣本通常被設計用于體內容積成像，使用需要特定樣本制備的系統，包括光片顯微鏡 [2]。因此，需要一種快速準確的篩選技術來確定斑馬魚下游光片顯微鏡成像是否存在適當的蛋白質表達。

斑馬魚篩選通常使用具有熒光成像功能的體視顯微鏡進行。然而，體視顯微鏡的局限性在于分辨率和靈敏度較低，這在表達量較低的樣本中尤為重要。傳統的寬場顯微鏡是一種高速成像技術，但也存在焦外模糊的問題，尤其是對于包括斑馬魚胚胎在內的較厚樣本。這種失焦模糊降低了對比度，而對比度對于斑馬魚的表達可視化至關重要。

配備 THUNDER 的 DM6 B 顯微鏡是一種用戶友好型系統，可通過它進行高速篩選：

• ?采用新型SynapseTM 系統實現高速觸發；

• ?采用 8 通道 LED 光源，提供柔和而有針對性的照明；

• ?利用高靈敏度 K8 相機檢測低表達蛋白；

• ?通過 LAS X Navigator 螺旋掃描快速概覽掃描，找到最佳轉基因斑馬魚；

• THUNDER ICC（實時即時圖像增強功能）可提高對比度，清晰顯示熒光蛋白。
  
  
  

  圖 1：THUNDER Imager Tissue 用于篩選轉基因斑馬魚。
  圖像由澳大利亞莫納什大學（Monash University）莫納什生物醫學發現研究所博士生 Laura Kreplin 提供。

  材料和方法

  在此工作流程中，轉基因斑馬魚被轉移到 35 毫米的培養皿中。不過，也有與THUNDER成像系統組織兼容的其他安裝平臺。

  使用低倍物鏡定位培養皿中的斑馬魚胚胎（圖 2）。

  LAS-X Navigator用于標記斑馬魚感興趣的區域（圖 3）。

  使用分辨率更高的物鏡來確定表達量是否足以進行下游成像。此類物鏡包括 HC FLUOTAR L 16x/0,60 IMM CORR VISIR (506533)、HC APO L 63x/0,90 W U-V-I (506148) 和 HC FLUOTAR L 25x/0,95 W VISIR (506374)。低 LED 光強度、K8 Scientific CMOS 攝像機 95% 的峰值 QE 和實時觸發相結合，確保在篩選過程中保留內源水平的蛋白質信號（圖 4）。
  
  
  
  

圖 2：使用 THUNDER Imager Tissue 上的 1.25x/0.04 干式物鏡拍攝的斑馬魚胚胎明場圖像。比例尺為 1500 µm。
圖像由澳大利亞墨爾本莫納什大學（Monash University）莫納什生物醫學發現研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

圖 3：使用 LAS X Navigator 發現的斑馬魚胚胎，并標記用于熒光篩選。

圖像由澳大利亞墨爾本莫納什大學（Monash University）莫納什生物醫學發現研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

圖 4：
A) 使用 16x/0.6 浸沒式下浸物鏡的 THUNDER Imager Tissue 配置。
B) 采用 THUNDER 實時即時計算清除成像（live instant computational clearing）獲得的斑馬魚胚胎圖像。成像 mKate 表達時，使用 LED 8 的 555 nm 激發線，在 2% 激發強度和 150 ms 曝光時間下獲取圖像。比例尺為 300 µm。
圖像由澳大利亞墨爾本莫納什大學（Monash University）莫納什生物醫學發現研究所 Dr. Senthil Arumugam 和博士生 Laura Kreplin 提供。

結論：

選擇具有適當轉基因能力的斑馬魚胚胎進行下游實驗，包括光片成像。DM6 B 配備了THUNDER技術，具有高速成像能力，而且對比度和靈敏度都有所提高，可用于成像低表達蛋白，有助于確保篩查結果的準確性和高效性。這項研究表明，DM6 B 和THUNDER技術可以幫助人們更好地理解發育生物學和其他相關領域的現象。

參考文獻：

1. Veldman, M. B.; Lin, S. 《斑馬魚作為兒科研究的發育模式生物》。兒科研究》，2008 年，64（5），470-476 頁。

2. Oates, A. C.; Naganathan, S. R. 從斑馬魚胚胎制備單節段外植體。JoVE 2022，第184期，e63196。

3. YouTube 采訪莫納什生物醫學發現研究所：研究生命系統& 利用顯微鏡觀察動態過程

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