AO/PI雙染試劑盒：細胞活力與凋亡檢測的強大工具

一瓶小小的雙色染料，竟能讓我們看清細胞的生與死

在細胞生物學(xué)研究中，準確區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞至關(guān)重要。AO/PI雙染試劑盒作為一種高效的細胞狀態(tài)檢測工具，通過熒光雙色標記，讓研究人員能夠快速、精準地掌握細胞的生命狀態(tài)。

一、AO/PI雙染試劑盒：原理與組成

AO/PI雙染試劑盒是基于兩種熒光染料——吖啶橙和碘化丙啶的獨特特性而設(shè)計的細胞狀態(tài)檢測工具。

吖啶橙

吖啶橙是一種具有膜通透性的熒光染料，能夠透過所有類型細胞的細胞膜，與細胞內(nèi)的DNA和RNA結(jié)合。它與DNA結(jié)合時發(fā)出綠色熒光（最da發(fā)射波長約530nm），與RNA結(jié)合時則發(fā)出紅色熒光（最da發(fā)射波長約640nm）。在細胞正常狀態(tài)下，AO使細胞核呈現(xiàn)綠色或黃綠色均勻熒光。

碘化丙啶

碘化丙啶則是一種非細胞膜通透性染料，它只能進入細胞膜受損的細胞（如壞死細胞），并與DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光（最da發(fā)射光波長為617nm）。對于細胞膜完整的活細胞和早期凋亡細胞，PI無法進入。

這兩種染料的巧妙組合，使得研究人員能夠在一次實驗中對不同狀態(tài)的細胞進行區(qū)分：活細胞顯示綠色，壞死細胞顯示紅色，而凋亡細胞則因染色質(zhì)固縮或斷裂，被AO染上致密濃染的黃綠色熒光或呈現(xiàn)黃綠色碎片狀。

試劑盒通常提供4種不同濃度的AO/PI組合，用戶可以根據(jù)實驗需求和所用細胞計數(shù)儀的特性，選擇最合適的配比，甚至可以自行混合調(diào)整染料濃度，以獲得最jia染色效果。

二、多領(lǐng)域應(yīng)用：這些實驗都需要AO/PI雙染

1. 細胞活力與毒性檢測

在藥物篩選和毒性測試中，AO/PI雙染是評估化合物對細胞影響的關(guān)鍵技術(shù)。通過統(tǒng)計活細胞與死細胞的比例，研究人員可以快速判斷藥物的細胞毒性強弱，為藥物開發(fā)提供重要參考數(shù)據(jù)。

2. 細胞凋亡研究

在癌癥研究和治療反應(yīng)監(jiān)測中，該試劑盒能夠有效區(qū)分凋亡細胞與壞死細胞。凋亡細胞會顯示致密濃染的黃綠色熒光或黃綠色碎片顆粒，而壞死細胞則呈現(xiàn)強烈的紅色熒光。這種區(qū)分對于研究化療藥物誘導(dǎo)的細胞死亡機制尤為重要。

3. 免疫細胞功能分析

在免疫學(xué)研究中，特別是在評估細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（CIK）等免疫細胞的活性和數(shù)量時，AO/PI雙染法表現(xiàn)出高度可靠性。有研究驗證了該方法在檢測CIK細胞培養(yǎng)全過程及凍存復(fù)蘇后細胞狀態(tài)中的有效性。

4. 三維細胞培養(yǎng)分析

傳統(tǒng)的二維細胞培養(yǎng)活性檢測方法往往不適用于復(fù)雜的3D模型。而AO/PI雙染試劑盒（如Cyto3D Live-Dead Assay Kit）專為3D和2D細胞培養(yǎng)設(shè)計，能夠有效評估3D培養(yǎng)體系中的細胞存活率。

5. 血液學(xué)與免疫學(xué)應(yīng)用

在外周血單個核細胞分析中，AO/PI雙染法具有獨特優(yōu)勢。研究表明，它能夠在不裂解紅細胞的情況下精確計數(shù)PBMC并進行活力分析，避免了因裂解操作導(dǎo)致的計數(shù)誤差。

6. 細胞治療與再生醫(yī)學(xué)

在細胞治療產(chǎn)品（如干細胞、免疫細胞）的制備和質(zhì)量控制中，AO/PI雙染是評估細胞活性的標準方法。它確保只有高質(zhì)量、高活力的細胞產(chǎn)品才會用于臨床治療。

三、實驗操作指南：從準備到結(jié)果分析

樣本準備

• 懸浮細胞：直接收集細胞，用PBS洗滌兩次后重懸于染色緩沖液中，調(diào)整細胞密度至1×10^6 cells/mL左右。

• 貼壁細胞：可用胰酶（不含EDTA）消化后制備成細胞懸液，或直接在培養(yǎng)板中原位染色。

染色過程

1. 取90-100μL細胞懸液，加入等體積或適當(dāng)比例的AO/PI雙染試劑

2. 輕輕吹打混勻，室溫避光孵育5-10分鐘

3. 對于某些實驗，可能需要用PBS洗滌兩次后再進行檢測

檢測與分析

• 熒光顯微鏡觀察：使用FITC濾光片觀察AO綠色熒光（活細胞），Cy3濾光片觀察PI紅色熒光（死細胞）

• 流式細胞儀分析：設(shè)置合適的熒光通道，AO綠色熒光通常檢測FITC通道，PI紅色熒光檢測PE或Cy3通道

• 自動細胞計數(shù)儀：專為細胞計數(shù)儀設(shè)計的試劑盒可直接上樣分析

結(jié)果判讀

• 活細胞：細胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光

• 早期凋亡細胞：染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂成點狀，呈致密濃染的黃綠色

• 晚期凋亡細胞：顯示紅色熒光，但細胞形態(tài)可能已發(fā)生變化

• 壞死細胞：呈強烈的紅色熒光，細胞結(jié)構(gòu)不完整

四、優(yōu)勢與局限性：明智選擇實驗方案

技術(shù)優(yōu)勢

1. 快速高效：整個染色過程通常在5-15分鐘內(nèi)完成，適合快速檢測

2. 操作簡便：無需復(fù)雜的樣本前處理，減少了操作步驟和誤差引入

3. 區(qū)分度高：能清晰區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，提供全面的細胞狀態(tài)信息

4. 應(yīng)用廣泛：兼容多種檢測平臺，包括熒光顯微鏡、流式細胞儀、自動細胞計數(shù)儀等

5. 靈敏度高：能夠檢測早期的細胞凋亡變化，優(yōu)于傳統(tǒng)的臺盼藍染色法

局限性與注意事項

1. 熒光淬滅：熒光染料均存在淬滅問題，需注意避光保存和操作

2. 時間敏感性：染色后需要盡快檢測，否則會影響結(jié)果準確性

3. 設(shè)備依賴：需要熒光檢測設(shè)備，可能不適用于基礎(chǔ)實驗室

4. 毒性物質(zhì)：PI是已知的誘變劑，操作時應(yīng)采取適當(dāng)防護措施

5. 優(yōu)化需求：不同細胞類型可能需要調(diào)整染料濃度和染色時間，建議xian進行預(yù)實驗優(yōu)化條件

五、與其他方法的比較

與傳統(tǒng)的臺盼藍排除法相比，AO/PI雙染不僅能夠區(qū)分活死細胞，還能識別凋亡細胞，提供更全面的細胞狀態(tài)信息。

與Annexin V-FITC/PI雙染法相比，AO/PI更側(cè)重于細胞膜的完整性和核染色質(zhì)的變化，而Annexin V/PI則檢測磷脂酰絲氨酸外翻，兩者在凋亡檢測的不同階段各有優(yōu)勢。

總結(jié)

AO/PI雙染試劑盒作為細胞狀態(tài)檢測的重要工具，以其快速、準確、多參數(shù)的優(yōu)勢，在生物醫(yī)學(xué)研究的多個領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用。無論是基礎(chǔ)的細胞培養(yǎng)質(zhì)量控制，還是前沿的藥物研發(fā)與疾病機制研究，掌握這一技術(shù)都將為科研工作提供有力支持。

隨著細胞分析技術(shù)的不斷發(fā)展，AO/PI雙染試劑盒的應(yīng)用前景將更加廣闊，特別是在3D細胞模型、實時動態(tài)監(jiān)測等新興領(lǐng)域，它將繼續(xù)幫助我們看清微觀世界的生命奧秘。

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