NHEK人表皮角質形成細胞培養技術要點

　　NHEK 人表皮角質形成細胞培養技術要點：標準化操作與優化方案
 

　　一、培養前核心準備
 

　　細胞與試劑選型：優先選用低代次(P3-P5)NHEK 細胞，保證增殖活性；培養基需搭配專用角質形成細胞無血清培養基，添加表皮生長因子(EGF)、胰島素等成分，避免血清干擾細胞分化。
 

　　耗材與環境滅菌：培養瓶 / 板需經膠原包被處理，增強細胞貼壁能力；所有耗材(移液管、離心管等)需無菌無酶，培養環境嚴格維持 37℃、5% CO?、濕度 95% 的恒溫恒濕條件。
 

　　二、關鍵培養操作步驟
 

　　復蘇操作規范：從液氮中取出細胞凍存管，37℃水浴快速解凍(1-2 分鐘)，1000rpm 離心 5 分鐘去除凍存液，加入預熱培養基重懸后接種，接種密度控制在 5×10³-1×10? cells/cm²。
 

　　換液與傳代時機：復蘇后 24 小時首次換液，去除未貼壁細胞；后續每 2-3 天換液 1 次，當細胞融合度達 70%-80% 時及時傳代，避免過度融合導致分化。
 

　　傳代操作細節：采用 0.25% 胰酶 - EDTA 消化液，37℃孵育 1-2 分鐘，顯微鏡下觀察到細胞變圓后，立即加入含中和劑的培養基終止消化，吹打時動作輕柔避免細胞損傷。
 

　　三、常見問題與優化措施
 

　　貼壁差問題：提前用 Ⅰ 型膠原或多聚賴氨酸包被培養表面，調整接種密度至適宜范圍，確保培養基中生長因子濃度達標。
 

　　分化過快問題：嚴格使用無血清專用培養基，避免培養環境中 CO?濃度波動，傳代時控制消化時間，減少細胞機械損傷。
 

　　污染防控要點：操作全程無菌，培養基中可添加適量雙抗(青霉素 - 鏈霉素)；定期檢測細胞形態，發現污染立即丟棄，避免交叉污染。