北京元森凱德氣管肺遞送裝置流感病毒小鼠肺炎模型

一、實驗目的

利用北京元森凱德（YSKD）研制生產的小動物氣管肺遞送裝置，通過氣溶膠氣管內接種方式構建流感病毒小鼠肺炎模型[Influenza virus aerosolization was accomplished with YSKD Biotech MicroSprayer ]，并與傳統鼻腔接種法進行對比，明確該裝置在模型構建中的優勢，建立標準化、高效且能模擬嚴重肺炎病理特征的實驗方案，為流感病毒致病性研究、抗病du藥物篩選及疫苗評價提供可靠的動物模型支撐。

二、實驗原理

北京元森凱德（YSKD）氣管肺遞送裝置可將流感病毒溶液霧化為特定粒徑的氣溶膠顆粒，通過精準靶向小鼠氣管及肺部，實現病毒的高效、均勻遞送。該方式能模擬人類流感病毒自然吸入感染途徑，且相較于鼻腔接種，可使病毒直接作用于肺部靶器官，充分利用肺部豐富的唾液酸受體（如α2,3-連接唾液酸受體），引發更接近臨床嚴重肺炎的病理反應，包括更高的病毒載量、更顯著的肺部損傷及強烈的炎癥應答。

三、實驗材料與儀器

（一）實驗動物

8周齡雌性C57BL/6J小鼠，體重18-22g，飼養于SPF級環境，自由攝食飲水，適應環境3天后進行實驗。實驗經動物倫理委員會批準。

（二）病毒株

鼠適應型流感病毒A/Puerto Rico/8/34（H1N1，PR8株），經雞胚培養擴增后，收集含病毒的尿囊液，分裝并于-80℃凍存備用。使用前經MDCK細胞進行空斑試驗測定病毒滴度（PFU/mL）。

（三）主要試劑及主要實驗儀器

麻醉劑：1%戊巴比tuo鈉溶液（現配現用）；

染色劑：臺盼藍（Trypan Blue）、花青染料（Cy7.5）；

基礎培養基：DMEM培養基（含10%胎牛血清、1%雙抗）；

核酸提取試劑：PureLink™ RNA Mini Kit（Thermo Fisher）；

ELISA試劑盒：小鼠IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1檢測試劑盒（Solarbio）；

組織固定液：4%多聚甲醛溶液；其他：PBS緩沖液、0.22μm濾膜、TPCK胰蛋白酶等。

核心裝置：北京元森凱德（YSKD）研制生產的小動物氣管肺遞送裝置（含YSKD Biotech MicroSprayer 霧化針、可視化小動物喉鏡、固定臺組件）；

四、實驗步驟

（一）實驗分組

將C57BL/6J小鼠隨機分為2組，每組根據病毒劑量再設亞組（4.6 PFU、83.8 PFU、420 PFU、1790 PFU），每組5只/時間點，另設PBS對照組：實驗組：氣溶膠氣管內接種組（i.t.組），使用北京元森凱德（YSKD）氣管肺遞送裝置接種；對照組：傳統鼻腔接種組（i.n.組），采用移液器滴鼻接種。病毒氣溶膠制備：取出凍存的PR8病毒液，于冰上解凍，用DMEM培養基稀釋至所需濃度（4.6-1790 PFU/50μL）；將稀釋后的病毒液加入北京元森凱德（YSKD）霧化器中，設置霧化參數；

（二）接種操作

1. 氣溶膠氣管內接種（i.t.組）

小鼠麻醉：腹腔注射1%戊巴比tuo鈉溶液（50μL/10g體重），待小鼠角膜反射消失后固定于手術臺；氣道暴露：將北京元森凱德（YSKD）小動物可視化喉鏡插入小鼠口腔深部，暴露聲帶；精準接種：將北京元森凱德（YSKD）氣管肺遞送裝置的霧化針插入氣管，快速推送50μL病毒氣溶膠溶液，確保氣溶膠直接進入肺部；術后護理：接種后將小鼠直立放置，待蘇醒后放回飼養籠，觀察2h確認無異常。

2. 傳統鼻腔接種（i.n.組）

小鼠輕度麻醉后，固定頭部呈仰臥位；用移液器吸取50μL病毒液，緩慢滴入小鼠單側鼻孔，待液體wan全吸入后再滴入另一側，避免嗆咳。

（三）接種效果驗證（可選，染色追蹤）

取部分小鼠，分別采用臺盼藍和Cy7.5進行接種：臺盼藍驗證：i.t.組和i.n.組分別接種50μL臺盼藍溶液，接種后立即處死小鼠，解剖取肺，觀察肺組織染色分布；

Cy7.5熒光驗證：接種后將小鼠置于IVIS成像系統中，設置激發波長770nm、發射波長820nm，進行活體成像；處死小鼠后取肺組織，進行離體成像，分析熒光強度和分布范圍。

（四）樣本采集

分別在接種后1天、3天、5天（dpi）采集樣本：生存與體重監測：每日記錄小鼠存活情況，測量體重變化，當體重下降超過25%時人道處死；

組織樣本采集：

肺組織：處死小鼠后，迅速分離左肺（用于病理檢測）和右肺（用于病毒載量、轉錄組分析）；右肺置于1mL DMEM培養基中，冰上研磨后離心（12000rpm，10min），取上清過0.22μm濾膜，備用；

支氣管肺泡灌洗液（BALF）：向氣管內注入800μL PBS，反復灌洗3次，收集灌洗液，4℃離心（3000g，10min），取上清用于ELISA檢測。

（五）各項指標檢測

1. 病毒載量與滴度檢測

病毒載量（Q-PCR）：采用PureLink™ RNA Mini Kit提取肺組織上清總RNA，以100ng核酸為模板，使用NP基因特異性引物（NP-forward：5'-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3'；NP-reverse：5'-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3'）進行RT-qPCR檢測；

病毒滴度（空斑試驗）：將肺組織上清進行10倍梯度稀釋，接種于MDCK細胞單層，培養48h后，計數空斑數，計算PFU/mL。

2. 病理組織學檢測

左肺組織置于4%多聚甲醛中固定24h，常規脫水、石蠟包埋、切片（5μm）；進行HE染色，光學顯微鏡下觀察肺泡壁增厚、炎癥細胞浸潤、血管水腫、出血等病理變化；采用4分制評分標準進行病理評分：0分（無病變）、1分（輕微病變）、2分（中度病變）、3分（重度病變）、4分（極重度病變）。

3. 肺濕/干比測定

取右肺部分組織，用濾紙吸干表面水分，稱取濕重（W）；80℃烘箱中烘干48h，稱取干重（D）；計算濕/干比（W/D），評估肺水腫程度。

4. 炎癥因子檢測

采用ELISA試劑盒檢測BALF中IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1的濃度，嚴格按照試劑盒說明書操作，酶標儀讀取OD值，計算濃度。

5. 轉錄組分析（5dpi樣本）

采用TRIzol試劑提取肺組織總RNA，DNase I消化去除DNA；檢測RNA純度（A260/A280=1.8-2.0）和完整性（1.5%瓊脂糖凝膠電泳）；取2μg合格RNA，使用KCTM Stranded mRNA Library Prep Kit構建測序文庫，富集200-500bps PCR產物；采用DNBSEQ-T7測序儀進行PE150測序，對測序數據進行差異表達基因（DEGs）篩選、GO和KEGG通路富集分析。

五、數據記錄與統計分析

記錄各組小鼠生存曲線、體重變化率、病毒載量、病理評分、炎癥因子濃度等數據；

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析：生存曲線用log-rank檢驗，多時間點兩組比較用ANOVA，兩組間比較用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

六、模型評價標準

接種效率：i.t.組肺組織病毒載量和滴度顯著高于i.n.組（P<0.05），Cy7.5熒光強度和分布范圍更廣泛；

病理特征：i.t.組肺組織病理評分、濕/干比顯著高于i.n.組，呈現更嚴重的肺泡壁增厚、炎癥浸潤和肺水腫；

炎癥應答：i.t.組BALF中IL-6、IL-1β、IL-17A、MPO、ICAM-1濃度顯著升高，轉錄組分析顯示炎癥通路（NOD樣受體通路、JAK-STAT通路等）顯著富集；

疾病嚴重程度：i.t.組小鼠體重下降更快、死亡率更高（83.8 PFU和420 PFU劑量下死亡率達100%），更符合嚴重肺炎模型特征。

七、展望

北京元森凱德（YSKD）研制生產的小動物氣管肺遞送裝置、YSKD Biotech小動物霧化給藥儀等動物吸入霧化裝置憑借精準靶向優勢，已成為呼吸道疾病模型構建的核心工具，未來發展潛力廣闊。技術層面，可融合智能控制系統，實現霧化粒徑、劑量的實時調節與精準反饋，適配不同品系、體重的實驗動物，進一步提升操作標準化。應用場景上，除流感病毒模型外，還可拓展至新冠病毒、呼吸道合胞病毒等多種病原體研究，以及慢阻肺、肺纖維化等慢性肺病的藥物遞送實驗。

同時，結合影像技術實現給藥過程與肺部沉積的動態可視化，將為藥代動力學研究提供更直觀的數據支撐。隨著生物醫藥領域的發展，該裝置有望成為連接基礎研究與臨床轉化的關鍵平臺，推動抗病du藥物與疫苗研發效率的大幅提升。

參考文獻：

1. Tetrahedral Framework Nucleic Acids Delivery of Pirfenidone for Anti-Inflammatory and Antioxidative Effects to Treat Idiopathic Pulmonary Fibrosis

2. Active-Ingredient Screening and Synergistic Action Mechanism of Shegan Mixture for Anti-Asthma Effects Based on Network Pharmacology in a Mouse Model of Asthma

3. Biological Hyperthermia-Inducing Nanoparticles for Specific Remodeling of the Extracellular Matrix Microenvironment  Enhance Pro-Apoptotic Therapy in Fibrosis

4. Inhaled immunoantimicrobials for the treatment of chronic obstructive pulmonary disease

5. Environmental factors ultraviolet a and ozone exacerbate the repeated inhalation toxicity of 6PPD in mice via accelerating the aging reaction

6. ITGAMmacrophage modulation as a potential strategy for treating neutrophilic Asthma: insights from bioinformatics analysis and in vivo experiments

附：北京元森凱德生物技術有限公司研制生產的動物霧化吸入給藥儀器，主要包括大/小動物肺部氣管直接遞送裝置（動物氣道霧化針）、小動物霧化給藥儀，動物口鼻吸入、僅鼻腔霧化/鼻腦給藥器、全身式暴露染毒、動物煙氣/PM2.5染毒系統、粉塵氣溶膠發生器、液體氣溶膠發生器、靜式吸入染毒柜、臭氧動物暴露裝置、動物高低壓氧艙，此外給客戶多樣化提供自動型實驗動物安樂處死系統（窒息系統、二氧化碳安樂處死箱），實驗動物除臭暫存系統，巴馬香豬皮，NGI Gentle Rocker智能洗盤裝置，NGI新一代撞擊器和ACI安德森撞擊器的校驗與檢測。

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