一、檸檬酸桿菌簡介

  檸檬酸桿菌（Citrobacter），革蘭氏陰性兼性厭氧菌。直桿菌、直徑約1.0μm，長2.0μm~6.0μm。有呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型。氧化酶陰性，動(dòng)力試驗(yàn)、ONPG試驗(yàn)陽性，能利用檸檬酸鹽，能夠液化明膠，DNA酶試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)陰性。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌學(xué)分類手冊》，檸檬酸桿菌屬分為弗氏檸檬酸桿菌（C.freundii）、科氏檸檬酸桿菌（C.diversus）和無丙二酸鹽檸檬酸桿菌（C.amalonaticus）三個(gè)種。

二、參考標(biāo)準(zhǔn)；

  《SN/T 2552.6-2010 乳與乳制品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)方法 第6部分：檸檬酸桿菌檢驗(yàn)》

三、檢測步驟及結(jié)果判斷

  3.1 增菌

  無菌稱取樣品100g，10g和1g各三份分別加入2000mL、250mL和100mL樣品稀釋瓶中，加入9倍預(yù)熱到45℃的滅菌蒸餾水（1:10稀釋），或者將樣品直接稱量到裝有9倍預(yù)熱到45℃的滅菌蒸餾水的樣品稀釋瓶中，振搖使樣品充分混勻，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

  分別移取培養(yǎng)18h~24h的懸液各10mL加入90mL四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）中，36℃±1℃培養(yǎng)18h～24h。

  四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）檢驗(yàn)原理：

  蛋白胨和牛肉粉提供碳源、氮源和維生素，滿足細(xì)菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；碳酸鈣能中和細(xì)菌產(chǎn)酸及吸收有毒的代謝產(chǎn)物；硫代硫酸鈉和四硫磺酸鈉結(jié)合可抑制腸道共生菌（四硫磺酸鈉是在培養(yǎng)基加入碘和碘化鉀時(shí)形成），而具有四硫磺酸鈉還原酶的細(xì)菌能在此培養(yǎng)基中繁殖；膽鹽和煌綠可抑制大腸群菌和其它革蘭氏陽性細(xì)菌。

  四硫磺酸鹽煌綠增菌肉湯（TTB）用法：

  稱取本品93.55g，溶解于1050mL蒸餾水中，加熱煮沸，121℃高壓滅菌15分鐘，臨用前加入20%碘液 20mL，0.1% 煌綠10mL，現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置。培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示：

圖1 弗氏檸檬酸桿菌在TTB中的培養(yǎng)結(jié)果

  3.2 分離培養(yǎng)

  輕輕混勻增菌液，每份增菌液用接種環(huán)接種沙門氏菌志賀氏菌分離瓊脂（SS）平板、亞硫酸鉍瓊脂（BS）平板。采用三區(qū)法或四區(qū)法劃線，以獲得單個(gè)菌落。將平板倒置于36℃±1℃，SS瓊脂平板培養(yǎng)18h～24h，BS瓊脂平板培養(yǎng)40h～48h。

  從SS平板和BS平板上分別挑取3個(gè)~5個(gè)可疑菌落，在營養(yǎng)瓊脂斜面上純化培養(yǎng)。檸檬酸桿菌在SS瓊脂平板上的可疑菌落為圓形，粉紅色、黑色、無色菌落，或粉紅色、黑色中心菌落；在BS瓊脂平板上的可疑菌落為棕綠色或棕黑色菌落。

  SS瓊脂培養(yǎng)基檢驗(yàn)原理：

  ?胨、牛肉浸粉提供碳源、氮源、維生素和礦物質(zhì)；乳糖為可發(fā)酵的糖類；三號(hào)膽鹽、枸櫞酸鈉和煌綠抑制革蘭氏陽性菌及大多數(shù)的大腸菌群和變形桿菌；硫代硫酸鈉和枸櫞酸鐵用于檢測硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色；中性紅為pH指示劑，發(fā)酵糖產(chǎn)酸的菌落呈紅色，不發(fā)酵糖的菌落為無色；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

  SS瓊脂培養(yǎng)基用法：

  稱取本品63.53g，溶解于1000mL蒸餾水中，加熱煮至沸，不必高壓蒸汽滅菌，冷至45℃-50℃倒成平板。培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示：

圖2 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在SS瓊脂平板上的培養(yǎng)結(jié)果

  亞硫酸鉍瓊脂（BS）檢驗(yàn)原理：

  蛋白胨、牛肉粉在培養(yǎng)基中作為基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)，為細(xì)菌生長提供所需的氮源、碳源、維生素及一些礦物質(zhì)等元素；葡萄糖可作為細(xì)菌生長代謝所需的能量物質(zhì)；磷酸鹽對(duì)培養(yǎng)環(huán)境pH值起到緩沖作用。煌綠和亞硫酸鈉能抑制大腸桿菌、變形桿菌和革蘭氏陽性菌的生長。傷寒沙門氏菌及其他沙門氏菌能利用葡萄糖，將亞硫酸鹽還原成硫化物并與硫酸亞鐵反應(yīng)使得菌落呈黑色，此外還可把鉍離子還原成金屬鉍，使菌落呈現(xiàn)金屬光澤，從而使沙門氏菌得到分離。

  亞硫酸鉍瓊脂（BS）用法：

  稱取本品50.3g，加入1000 mL蒸餾水中，加熱煮沸至完--全溶解，冷至45℃-50℃，搖勻，傾入無菌平皿備用。無需高壓滅菌。保存于黑暗處，48小時(shí)內(nèi)使用。培養(yǎng)結(jié)果如圖3所示：

圖3 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864在BS瓊脂平板上的培養(yǎng)結(jié)果

  3.3 分離鑒定

  3.3.1 方法選擇

  對(duì)挑選的菌體進(jìn)行革蘭氏染色，氧化酶試驗(yàn)初步生化鑒定。革蘭氏染色陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性按3.3.2進(jìn)行初步生化試驗(yàn)。革蘭氏染色結(jié)果如圖4A，氧化酶試驗(yàn)結(jié)果如圖4B：

圖4 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864革蘭氏染色結(jié)果，弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864氧化酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果

  3.3.2 初步生化鑒定

  使用營養(yǎng)瓊脂平板或斜面上純化分離的新鮮培養(yǎng)物（培養(yǎng)時(shí)間不超過24h）進(jìn)行動(dòng)力試驗(yàn)、ONPG試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、DNA酶試驗(yàn)（或明膠液化試驗(yàn)）和V-P試驗(yàn)。動(dòng)力試驗(yàn)、ONPG試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)陽性，DNA酶試驗(yàn)（或明膠液化試驗(yàn)）和V-P試驗(yàn)陰性的菌落為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。再次用營養(yǎng)瓊脂純化培養(yǎng)18h～24h后，進(jìn)行后續(xù)生化試驗(yàn)。初步生化鑒定結(jié)果如圖5所示：

圖5 弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864初步生化鑒定結(jié)果

  3.3.3 生化鑒定

  使用營養(yǎng)瓊脂上的新鮮培養(yǎng)物（培養(yǎng)時(shí)間不超過24 h）按表1各項(xiàng)生化試驗(yàn)進(jìn)行檸檬酸桿菌各種的鑒定。確證鑒定結(jié)果如圖6所示：

表1 檸檬酸桿菌屬生化鑒定表

圖6 弗氏檸檬酸桿菌確證生化鑒定結(jié)果

四、結(jié)果判定與結(jié)果報(bào)告

  4.1 結(jié)果判定

  4.1.1 檸檬酸桿菌屬

  革蘭氏染色陰性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，生化反應(yīng)符合3.3.2要求的菌落，判定為檸檬酸桿菌屬細(xì)菌。

  4.1.2 檸檬酸桿菌

  革蘭氏染色陰性，氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，生化反應(yīng)結(jié)果與3.3.2和3.3.3中表1的生化反應(yīng)結(jié)果相符，或根據(jù)生化鑒定試劑盒、生化鑒定系統(tǒng)鑒定到檸檬酸桿菌屬的結(jié)果，可判定為特定的檸檬酸桿菌。

  4.2 結(jié)果報(bào)告

  生化鑒定結(jié)果符合檸檬酸桿菌生化特性，按增菌培養(yǎng)的陽性瓶數(shù)，應(yīng)用MPN表，查出每100 g樣品中的MPN值。檢測結(jié)果報(bào)告為每100 g樣品中檸檬酸桿菌（屬或種）的MPN值。

表2 最可能數(shù)（MPN）表（95%置信區(qū)間）

使用三管法，接種量分別為10.0 g，1.0 g和0.1 g。

注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。