外泌體的觀察與分析

外泌體的觀察與分析

近年來，體內腫瘤細胞、免疫細胞等各類細胞分泌的細胞外囊泡（EV：extracellular vesicles）開始受到關注。細胞外囊泡存在于絕大多數的體液（血液、尿、髓液等）及細胞培養液中，是一種細胞分泌的小型（直徑約30 nm至100 nm）囊泡。
根據不同的生成機制，細胞外囊泡可進一步細分為“外泌體（exosomes）"、“微泡（MV：microvesicles）"和“凋亡小體（apoptotic bodies）"。在過去的很長一段時間里，外泌體都被視為一種釋放無用細胞內容物的囊泡。但是近年來，人們發現外泌體其實與惡性疾病、免疫疾病、神經疾病、傳染病等各類疾病有著密切的關聯，或許能夠幫助人們查明病狀，為治療帶來更多的可能性，這也使外泌體成為了備受關注的焦點。
下面我們將基于外泌體的生成機制、功能作用，以及相關的疾病治療案例，從基礎知識出發，介紹相關的觀察事例。如果您對外泌體感興趣，或是正在為觀察分析方法感到困擾，希望下面的內容能夠為您提供參考。

■什么是外泌體

外泌體是細胞外囊泡的一種。細胞可利用一種名為“內吞作用（endocytosis）"的機制，將細胞外的物質轉運到細胞內，生成名為“內體（endosome）"的囊泡。生成的囊泡將依次經歷網格蛋白囊泡?初級內體?次級內體階段。隨后，含有大量腔內囊泡（ILV：intraluminal membrane vesicle）的多泡體（MVB：multivesicular body）會與細胞膜發生融合，將囊泡由內體釋放到細胞外。這些被釋放出來的囊泡，就是外泌體。
外泌體中含有各類蛋白質及核糖核酸（RNA：ribonucleic acid），這些成分源自各類分泌細胞，例如內體及細胞膜中的蛋白質、與細胞內運輸相關的蛋白質等等。外泌體中還含有內體膜中的脂質和分泌細胞的細胞膜成分，這些內容物被稱為“運輸物（cargo）"。這種外泌體會被其他細胞吞食，外泌體內攜帶的蛋白質及RNA也會被傳遞到吞食外泌體的細胞中。
由此可見，外泌體在細胞間信息傳遞中發揮著重要的作用，尤其是在醫療領域，圍繞外泌體的研究正在不斷推進當中。

■外泌體的攝取和作用

細胞攝取外泌體的機制目前尚不明晰，但報告顯示受體細胞需要識別外泌體表面的分子。
外泌體的囊膜由脂質筏、膜轉運蛋白和CD9/CD63/CD81等跨膜蛋白組成，但脂質的組成會根據其來源細胞而變化。而且，受體細胞是否具有能夠識別外泌體表面分子的分子取決于受體細胞自身。
因此，在外泌體的藥代動力學中，其囊膜與受體細胞分子的組合十分重要。

細胞攝取的外泌體經由核酸將信息遞送給受體細胞。受體細胞基于核酸信息合成蛋白質。結果表明，免疫系統細胞分泌的外泌體抑制了某個特定基因的表達，并且促進了免疫反應。
例如，樹突狀細胞（一種抗原呈遞細胞）分泌的外泌體含有MHC分子，因此通過將它們注入遠離樹突狀細胞的T細胞中，可以激活T細胞。

■基于外泌體的疾病治療

隨著外泌體功能的日益明了，在以癌癥早期發現、阿爾茲海默病、帕金森氏病、脊髓小腦變性癥、亨廷頓病、ALS等神經變性疾病治療為代表的醫學領域，將外泌體用于內分泌、循環系統的治療法及診斷法研究正在如火如荼地開展當中。

■癌癥的早期發現

研究人員認為，外泌體可能與癌細胞的生存及惡化、轉移等存在關聯。在癌癥患者體內癌細胞釋放的外泌體中，含有源于癌細胞的各類蛋白質，會激活癌細胞的細胞殺傷性T細胞。這是因為源于癌細胞的外泌體含有癌癥基因。這也就意味著，通過觀察癌癥患者體內細胞釋放的外泌體，就能實現癌癥的早期檢測。
作為一種著眼于外泌體細胞間信息傳遞性質的癌癥診斷法，液體活檢（liquid biopsy）是發現早期癌癥的重要手段。在基于液體活檢的癌癥診斷中，外泌體內容物能夠反映釋放源細胞的特征，例如癌癥相關基因發生變異的ctDNA（circulating tumor DNA），因此通過調查異常細胞的外泌體，或許能夠實現癌癥的早期發現。

■阿爾茲海默病的治療

阿爾茲海默病是一種因β-淀粉樣蛋白毒性損傷致使神經細胞死亡，引起癡呆癥。在阿爾茲海默病的治療中，外泌體會對作為病因物質的β-淀粉樣蛋白及Tau蛋白*4的增減造成較大的影響。
除此以外，為了更加安全地將醫藥品高效輸送（delivery）至特定的患病組織及細胞，研究者們正在嘗試在“藥物傳遞系統（DDS：drug delivery system）"中，將藥劑、核酸等封入外泌體，實現精準給藥。

*4：Tau蛋白（tau protein）

Tau蛋白是一種存在于中樞及末梢神經系統神經細胞中的蛋白質。它會與多種蛋白質結合，參與發生在腦神經系統中的各類現象，例如腦部的后天發育、成體的神經發生等等。這種Tau蛋白的異常，或許就是阿爾茲海默病等神經變性疾病的發病原因。

■用于再生醫療

基于外泌體的再生醫療是指將干細胞等人工構建的組織移植到患者體內，從而再生和恢復受損臟器及組織的醫療方法。
間充質干細胞（Mensenchymal Stem Cell：MSC）分泌的外泌體（MSC外泌體）對癌癥、腎臟疾病、心肌疾病、腦部疾病、肺部疾病等多種疾病具有治療效果。此外，MSC還可以分化為內胚層及外胚層細胞，未分化的MSC分泌的分子對特定疾病以外的許多疾病具有治療效果。
MSC具有“歸巢"的能力，能夠自發尋找損傷的部位并集中于所找到的部位，這種能力可以用于對過去無法給藥的臟器和組織進行靜脈給藥。然后，積聚在損傷部位的MSC會分泌MSC外泌體用于再生和恢復組織。
由此，基于MSC外泌體的再生醫療展現出與基于iPS細胞的再生醫療不同的細胞療法，在細胞治療領域，尤其是作為新型病毒感染的療法備受關注。

■液體活檢診斷

液體活檢（liquid biopsy）就是利用對身體負擔較小的體液（體液、血液、尿液等樣本）進行活檢的技術，主要在癌癥診斷領域發揮作用。
液體活檢的樣本中含有源自腫瘤及各類組織、細胞的信息，觀察這些樣本，可以全面掌握全身的腫瘤狀況。
利用內窺鏡及穿刺針采集樣本的活檢技術，不僅會給病人帶來痛苦與風險，還只能采集極少部分的腫瘤組織，只能檢測到零碎的癌癥信息。
液體活檢光用體液就能完成檢測，可以在不對人體造成負擔的前提下，開展癌癥基因診斷及治療效果預測。

■什么是藥物傳遞系統（DDS：drug delivery system）

藥物傳遞系統是一種利用外泌體細胞間物質轉運特性的治療方法，可以將物質（蛋白質、核酸、脂質）運輸到特定的細胞中。
這種療法面世至今，已經成功驗證了其對乳腺癌細胞的抗癌作用，并且曾通過將藥物導入神經母細胞瘤細胞，成功減少了阿爾茲海默病誘發物質——β-淀粉樣蛋白的量。
作為一種采用生物分子的療法，外泌體DDS療法與傳統的納米微粒藥物運輸療法相比，毒性更低。人們在研究中還發現，外泌體DDS能夠到達傳統療法難以穿透的組織深處，因此外泌體作為一種強有效的運輸分子，正在受到越來越多的關注。

■外泌體研究的展望

正如上文所說，隨著醫學及觀察技術的發展，“傳遞細胞信息＝疾病轉移"這一外泌體的負面特性搖身一變，成為了在疾病預防、早期治療、細胞直接靶向投藥等領域開辟療法的Ace，并因此備受關注。
其實，蔬菜瓜果等植物的細胞同樣會分泌外泌體。以生姜為例，生姜具有抑制酒精性肝損傷的效果，這或許是因為生姜釋放的外泌體具有一定的護肝作用，可避免肝臟受損。還有研究報告指出，煮雞蛋的外泌體具有抑制動脈硬化，增強記憶力的效果。
東方醫學認為膳食乃醫療之本，治療疾病的藥物與促進健康的食物，原本就是同根同源的存在。從這一觀點來看，圍繞外泌體的研究給醫療和食品帶來了更多的可能性，堪稱是現代版的“藥食同源"。

■外泌體的檢測

外泌體的分析方法大致可分為2種。一種是從體液及細胞培養液中提取外泌體，對由外泌體運輸的蛋白質、脂質及RNA進行分析的方法。另一種則是直接在體液中檢測分析外泌體的方法。外泌體被細胞吞食及分泌的具體過程，需借助熒光顯微成像系統進行觀察及分析。

■使用體液及細胞培養液的分析方法

通常情況下，會采用超離心、超過濾等方法從血液、腹水等體液樣本中分離提純外泌體。但是，用此類方法提取到的外泌體，會混入性狀、濃度相近的其他粒子、高質量蛋白質等雜質，很難單獨分析外泌體。
為了解決這一問題，有時也會配合使用親和純化*1技術。為了確認最終分離提純所得的樣本是否為外泌體，還會借助動態光散射法或顯微鏡進行尺寸核實或者通過蛋白質印跡法進行驗證*2。

*1：親和純化（affinity purification）

利用能夠與目標分子進行特異性可逆結合的分子（配體）反應，對目標分子、蛋白質或相應復合體實施分離提純的方法。

*2：蛋白質印跡法（western blotting：WB）

一種用于了解蛋白質特性的基礎實驗方法，可用于測量在外泌體中表達的蛋白質。

■直接從體內進行檢測的方法

人們正在研究無需分離提純外泌體，直接在體液中進行檢測的方法，例如，常被用于癌癥治療領域的，“流式細胞光度術*3"、“微陣列分析"、“表面等離子共振"等等。除此以外，還有以大腸癌診斷為目的的ExoScreen法。
不同于利用內窺鏡及穿刺針采集腫瘤組織的傳統活檢（biopsy），以血液等體液為樣本，實施診斷及治療效果預測的“液體活檢（liquid biopsy）"，已經成為了一種備受期待的新興腫瘤早期發現技術。

*3：流式細胞光度術（flow cytometry）

利用以激光照射細胞及微粒時產生的散射光或熒光，對粒子特性進行評估的技術。能夠同時對單種細胞（細胞、細菌等）的多項特征進行高速測量。適用于評估外泌體的蛋白質表達量及其進入細胞內部的情況。雖然難以進行定量分析及囊泡種類的區分，卻是一種能夠觀察細胞內吞外泌體過程的極簡便方法。

■外泌體的觀察和分析

外泌體的直徑約為30 nm至150 nm，很難用光學顯微鏡觀察。使用電子顯微鏡則要面臨繁瑣的制樣操作、真空和電子束導致變質的問題，物性測量也并不常見。最關鍵的是，電子顯微鏡并非適用于所有設施。
而利用熒光顯微成像系統觀察外泌體，則能借助熒光標記實現外泌體的可視化，進行跟蹤觀察?？梢杂脽晒馍貙μ崛〉降耐?/span>泌體中所含的RNA（RNA運輸物）或外泌體膜進行染色，實現可視化觀察。
借助上述方法，可以對外泌體的經時分布變化，外泌體的細胞間信息傳遞過程（即細胞內吞外泌體的情況）進行監控。熒光顯微成像系統能夠進行其他方法難以實現的觀察，例如觀察外泌體變化及相應過程等，作為一項可實現更高精度分析的新技術而備受關注。

■通過熒光顯微鏡確認外泌體的三維定位

使用熒光顯微鏡很難對焦，給觀察定位帶來了不小的困難。而使用流式細胞分析儀（利用以激光照射細胞及微粒時產生的散射光或熒光，對粒子特性進行評估的儀器）進行分析，則無法確認定位及經時變化。
一體化熒光顯微成像系統BZ-X使用基于“電氣投影元件"的結構化照明（Structured Illumination），運用出色的光學切片技術，呈現清晰圖像。定位及經時變化都能清晰呈現。
在下列示例中，研究者利用BZ-X的切片功能，對人類表皮細胞中外泌體進行了定位觀察。
BZ-X能夠借助高精細圖像，觀察某個細胞釋放的外泌體，移動進入其他細胞內部的過程。

■如果引進一體化熒光顯微成像系統BZ-X

·       全電動控制，操作簡單便捷。能夠輕松移動到目標觀察位置，實現高效觀察。

·       借助可進行光學切片拍攝的切片功能，不會拍攝出非焦平面的熒光模糊圖像，對微弱信號也能清晰捕捉。

·       可根據Z方向的移動間距信息構建高精細的渲染后的3D圖像?？蓪毎ㄎ贿M行三維觀察。

·       可利用延時拍攝，輕松拍攝到目標物的經時變化。

基恩士 一體化熒光顯微成像系統 BZ-X1000系列，

在醫學與生命科學等領域應用廣泛。

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