WB 實驗即蛋白質(zhì)印跡法，是分子生物學、生物化學等領(lǐng)域常用的實驗技術(shù)。它依據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合原理，能對樣品中的特定蛋白質(zhì)進行定性或半定量分析。WB 實驗憑借高特異性和靈敏度，在蛋白質(zhì)表達水平研究、蛋白質(zhì)分子大小鑒定、疾病標志物檢測等方面發(fā)揮著重要作用，是生命科學研究中不ke或缺的有力工具。
實驗原理
WB實驗基于抗原-抗體的特異性結(jié)合反應，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將其轉(zhuǎn)移至固相載體(如PVDF膜)，再利用特異性一抗和酶標記二抗進行檢測，最終通過化學發(fā)光或顯色反應實現(xiàn)目標蛋白的定性、定位及半定量分析。
實驗步驟
一、樣本制備
1.樣本收集
①貼壁細胞收集：吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次，利用細胞刮或胰酶消化收集貼壁細胞，細胞轉(zhuǎn)移到離心管，離心收集細胞沉淀。
②懸浮細胞收集：先離心收集細胞沉淀，再用預冷 PBS 輕輕吹打重懸，然后離心收集細胞沉淀。
③動物組織樣本收集：在冰上用干凈的醫(yī)用剪將組織剪成小塊。然后在液氮中將組織研磨粉碎。
④植物樣本收集：取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后的植物組織放于研缽進行研磨，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。
2.總蛋白提取
①細胞/組織裂解：
細胞樣本，加入預冷的裂解緩沖液(含有 PMSF/蛋白酶抑制劑)，冰上裂解 15min。
組織樣本，按照 1mL 裂解液/100mg 組織向勻漿器中加入蛋白裂解液，多次勻漿，直至組織完quan勻漿，收集勻漿液。
②把裂解好的樣本12000rpm離心10min，取上清用于后續(xù)實驗。
③蛋白變性：
吸取 10μl 蛋白上清做蛋白濃度（BCA 法）測定。向剩余的蛋白提取液中加 5× Loading Buffer（最終工作液為 1x)，95℃加熱變性 10min，待液體完quan冷卻后置于-20℃分裝保存，避免反復凍融。
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二、蛋白濃度測定
1.BCA法
測定原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu+。BCA與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍色復合物，在562 nm處有高的光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。
特點：靈敏度高，操作簡單，試劑及其形成的紫藍色復合物穩(wěn)定性俱佳，并且受干擾物質(zhì)影響小，不受去垢劑的影響。
2.Bradford法
測定原理：在酸性條件下考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue G-250)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色由棕色變?yōu)樗{色，形成的復合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關(guān)系，因此可以在595 nm波長下測定吸光度值從而計算蛋白含量。
特點：操作簡單，對EDTA、EGTA等還原劑兼容性好，但易受強堿性和高濃度去污劑影響。
3.Lowry法
測定原理：堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物此絡(luò)合物將Folin試劑還原，產(chǎn)生深藍色，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。
特點：不受脂類物質(zhì)干擾，也能耐受相當濃度的去垢劑如SDS。
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三、凝膠電泳
1.制膠
①取干凈的膠板，用水沖洗后，擦拭干凈，對齊插入板夾中。
②檢漏:加入水檢查是否漏水(20min)，將水倒掉，用吸水紙吸干凈。
③配分離膠：取干凈的空燒杯，按照下層膠配比(分離膠)依次加入、混勻。加TEMED之后混合均勻，迅速加入兩板之間，液體加至距短板上約2cm處停止加液。用異丙醇進行液封，室溫放置待下層膠凝固(20min)，倒掉上層液體，吸水紙吸干水。
④配濃縮膠：按比例配制濃縮膠，加速混勻，迅速加入兩板之間。插入梳子，室溫放置，待上層膠凝固(20min)。從固定臺上取下夾板，打開夾子。
注：除了添加各種試劑手工配膠，目前還有制膠試劑盒和預制膠的兩種更加方便快速的制膠方法。
濃縮膠濃度選擇：
2.跑膠
①將膠板上的梳子拔出后，在流水中輕柔沖洗上樣孔，將碎膠沖出孔外。
②將膠板組裝在電泳儀器上，注意短的玻璃板朝電泳槽內(nèi)放置，要對齊夾緊不能漏液。
③加入電泳液，內(nèi)槽必須加滿電泳緩沖液，外槽可以不加滿。
注：注意觀察內(nèi)槽是否漏液，若漏液的話需要重新裝板。
④按照方案將蛋白和marker加入上樣孔中，目的蛋白每孔上樣量20μg-40μg，內(nèi)參蛋白每孔上樣量5μg-10μg。marker的用量參考試劑說明書。
⑤蓋上蓋子，注意不要弄錯方向，連接電源；濃縮膠設(shè)置恒壓80V，跑膠30min左右，然后設(shè)置分離膠恒壓120V，至溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳。
注：不同的膠跑膠時間可能會有區(qū)別，主要以第一次實驗建議多觀察幾次，記錄跑膠所需要的時間。
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四、轉(zhuǎn)膜
1. 將PVDF膜浸泡在甲醇中激活30s。
注：PVDF膜有0.22μm和0.45μm兩種規(guī)格的，20KD以下蛋白建議選用0.22μm的，20KD以上蛋白建議選用0.45μm的。
2. 電泳結(jié)束后將膠板取出，短玻璃板朝上放置，揭開短玻璃板后切除多余的膠，在水中將膠從長玻璃板上取下。
3. 在電轉(zhuǎn)液中，轉(zhuǎn)膜夾黑色面朝下，依次放置海綿-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿（三明治結(jié)構(gòu)），夾緊轉(zhuǎn)膜夾，PVDF膜要與膠貼合，排走氣泡。調(diào)整轉(zhuǎn)膜夾黑色界面轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)膜槽負極，白色面朝向轉(zhuǎn)膜槽正極。灌滿轉(zhuǎn)膜液后，用200-400mA恒定電流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜要在冰浴中進行。
注：轉(zhuǎn)膜的時間和蛋白大小、電流大小及轉(zhuǎn)膜液的類型有關(guān)。
轉(zhuǎn)膜條件選擇：
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五、封閉
1. 將膜取出后，應觀察到marker完quan從膠轉(zhuǎn)移至膜上。
2. 用TBST清洗掉膜上殘留的轉(zhuǎn)膜液，每次5-10分鐘，洗3-5次。
3. 將PVDF膜浸泡在5% 脫脂牛奶中，緩慢搖蕩，室溫孵育1h。
注：除脫脂牛奶，封閉也可以用BSA或者商品化的封閉液。
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六、抗體孵育
1. 孵育一抗：封閉結(jié)束后，用1xTBST緩沖液洗掉多余封閉液，洗膜每次5-10min，共3-5次。一抗使用一抗稀釋液或TBST按照抗體說明書建議的比例稀釋(具體條件自行摸索)使用，然后將膜浸泡在一抗中，于4℃冰箱中搖床孵育過夜，一抗孵育后可以回收。
2. 孵育二抗：用1xTBST緩沖液洗掉多余一抗，洗膜每次5-10min，洗3-5次。使用5%脫脂牛奶或商品化抗體稀釋液按照說明書推薦比例稀釋二抗，室溫慢搖1h。
3. 洗膜：二抗孵育完畢后，回收二抗，用1xTBST洗膜，每次5-10min，洗3-5次。
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七、曝光
1. 配置顯影液(A液:B液=1:1)，避光。
2. 顯影液滴于PVDF膜上，孵育1-3min。
3. 孵育結(jié)束后，垂直吸取多余發(fā)光液，蛋白面朝上置于儀器中，可裁剪錫箔紙遮光。
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