類器官與自體免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，評(píng)估靶向mesothelin的納米疫苗

一）《Advanced Human Immune Cell‐Organoid Co-Cultures for Functional Testing of Cancer Nanovaccines》的研究發(fā)表于 Advanced Science（2025），由德國、荷蘭、西班牙多家機(jī)構(gòu)聯(lián)合完成。文章構(gòu)建了一個(gè)基于人源胰腺癌類器官（PDAC PDO）與自體免疫細(xì)胞共培養(yǎng)的體外平臺(tái)，用于評(píng)估靶向mesothelin（MSLN）的納米疫苗（Mesovac）單獨(dú)或聯(lián)合化療（FOLFIRINOX）和免疫治療（Atezolizumab）的療效與機(jī)制。

?? 一、研究背景與核心問題

?? 二、技術(shù)路線與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（四步閉環(huán)）

?? 三、關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)與數(shù)據(jù)解讀

1. Mesovac疫苗組成

2. 類器官模型構(gòu)建（詳見下文附件）

來源：PDAC患者術(shù)后組織（HLA-A02:01+）

驗(yàn)證：

IHC/qPCR確認(rèn)MSLN表達(dá)差異

RNA-seq確認(rèn)KRAS/TP53/SMAD4突變（典型PDAC特征）

MSLN敲除（shRNA）作為陰性對(duì)照

3. T細(xì)胞來源與激活

4. 共培養(yǎng)系統(tǒng)

5. 聯(lián)合治療效應(yīng)

?? 四、研究意義與展望

?? 五、總結(jié)

本研究構(gòu)建了一個(gè) 基于人源胰腺癌類器官與自體免疫細(xì)胞共培養(yǎng)的體外評(píng)估平臺(tái) ，證實(shí) MSLN納米疫苗聯(lián)合FOLFIRINOX與Atezolizumab 可 特異性激活T細(xì)胞、清除癌干細(xì)胞與耐藥細(xì)胞 ，為 胰腺癌個(gè)性化免疫治療 提供了 可替代動(dòng)物模型的臨床前驗(yàn)證系統(tǒng) 。

（二）附：原文中類器官模型構(gòu)建

一、組織獲取與倫理

1. 來源：

2. 接受切除術(shù)的 PDAC 患者，術(shù)中取腫瘤主體部位（tumor bulk）。

3. 所有樣本均來自德國哥廷根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心“Molecular Pancreas Program (MolPAC)"隊(duì)列。

4. 倫理批件：

5. 本地監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)號(hào)：11/5/17、22/8/21ü、2/4/19。

6. 患者簽署書面知情同意，符合《赫爾辛基宣言》。

二、PDO 建立（2D→3D 轉(zhuǎn)換）

1. 清洗與切碎：

2. 新鮮組織立即置于預(yù)冷 PBS中，4 °C 運(yùn)輸；用無菌剪刀將腫瘤剪成< 1 mm3碎塊。

3. 酶消化：

4. 加入5 mg/mL Collagenase IV + 0.1 mg/mL DNase I（Gibco），37 °C 搖床 30–45 min；每 10 min 用 1 mL 槍頭吹打 10 次，直至無明顯大塊。

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1. 過濾與離心：

2. 70 µm 細(xì)胞篩過濾；300 × g，4 °C，5 min 離心；紅細(xì)胞裂解（ACK 緩沖液，2 min）→ 再次離心。

3. 基質(zhì)膠包埋：

4. 細(xì)胞沉淀重懸于冰上預(yù)冷的 Matrigel（Corning，#356231）；密度：1 × 10? 細(xì)胞 / 15 µL Matrigel；點(diǎn)膠于 24 孔板底部，每孔 3–4 滴，形成“dome"；37 °C 固化 15 min。

5. 培養(yǎng)體系（HOGM 培養(yǎng)基）：

6. 
   

1. 傳代：

2.  每 7–10 天用冷 PBS吹打 dome，離心回收； 1:3–1:6 分傳，第 3–5 代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，確保形態(tài)與突變譜穩(wěn)定。

三、質(zhì)控與表征

1. 形態(tài)學(xué)：

2.  明場(chǎng)顯微鏡每日觀察，典型囊性/葡萄樣結(jié)構(gòu)為健康標(biāo)志；出現(xiàn)實(shí)心或黑色核心>30 % 即丟棄。

3. 組織病理復(fù)現(xiàn)：

4. 4 % PFA 固定→石蠟包埋→HE & IHC（CK19、MUC1、MSLN）確認(rèn)與原發(fā)瘤一致。

5. 基因型：

6. RNA-seq 檢測(cè)KRAS G12D/V、TP53、SMAD4等驅(qū)動(dòng)突變；短串聯(lián)重復(fù)（STR）鑒定與患者組織100 % 匹配。

7. MSLN 表達(dá)分層：

8. qPCR：ΔCT 法，內(nèi)參 β-actin；

9. 流式：anti-MSLN-PE（Santa Cruz sc-33672）；

10. 根據(jù)中位值將 PDO 分為MSLN-high與MSLN-low兩組，用于后續(xù)殺傷實(shí)驗(yàn)。

四、MSLN 敲除 PDO（陰性對(duì)照）

1. shRNA 載體：

2. Target sequence: 5′-GCTGACCTTACAGTGAATA-3′（MSLN 3’UTR）；

3. 載體：pLKO.1-puro-mCherry（VB240722-1232ymd，VectorBuilder）。

4. 感染流程：

5. 單細(xì)胞懸液 + 病毒（MOI = 500）+ 10 µg/mL Polybrene；離心感染（800 × g，45 min，32 °C）；24 h 后換液，72 h 加 2 µg/mL puromycin 篩選 7 天；

6. 流式分選 mCherry? 群體，敲降效率>80 %（qPCR & WB 驗(yàn)證）。

五、冷凍與復(fù)蘇

凍存液：90 % FBS + 10 % DMSO，1 °C/min梯度降溫至 –80 °C，次日轉(zhuǎn)液氮。

復(fù)蘇：37 °C 水浴快速融化→冷 PBS 稀釋 10 倍→離心→重懸于 Matrigel，存活率>90 %。

六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. Matrigel 必須全程冰上，任何升溫均會(huì)導(dǎo)致提前聚合。

2. Wnt3a/RSPO1 條件培養(yǎng)基需新鮮收集（< 2 周），活性下降會(huì)直接導(dǎo)致 PDO 生長停滯。

3. Y-27632 僅前 3 天使用，長期存在會(huì)改變類器官基因表達(dá)譜。

4. 每批次 PDO 需重新檢測(cè) MSLN 表達(dá)，因隨傳代可能出現(xiàn)表達(dá)漂移。

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