共聚焦顯微穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜系統(tǒng)應(yīng)用

顯微穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜

熒光，是一種物質(zhì)光致發(fā)光現(xiàn)象。物質(zhì)產(chǎn)生熒光需要具備特定的結(jié)構(gòu)和電子躍遷特性。通常，具有共軛雙鍵體系、剛性平面結(jié)構(gòu)以及特定的官能團(tuán)等特征的分子更容易產(chǎn)生熒光。從微觀角度分析，當(dāng)物質(zhì)分子受到光照射時，分子會在吸收光子能量時被激發(fā)，分子內(nèi)的電子會從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的電子是不穩(wěn)定的，會在很短的時間內(nèi)（通常在10??到10??秒之間）回到基態(tài)，同時以光的形式釋放出多余的能量，這種發(fā)射出的光就被稱為熒光。

圖1 熒光原理圖

熒光光譜在時域上分為穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜。穩(wěn)態(tài)熒光光譜主要研究物質(zhì)在連續(xù)光源照射下的熒光信號，檢測熒光信號/強(qiáng)度(y)是波長(x)的函數(shù)。瞬態(tài)熒光光譜主要研究物質(zhì)在脈沖光源照射后，熒光信號/強(qiáng)度隨時間的變化，一般檢測的熒光信號/強(qiáng)度(y)是時間(x)的函數(shù)。瞬態(tài)熒光光譜又稱熒光壽命曲線/時間分辨熒光光譜(TRPL),在瞬態(tài)熒光領(lǐng)域中，熒光壽命是對時間分辨熒光光譜的具體解釋，其定義為熒光物質(zhì)在吸收光能量后被激發(fā)到激發(fā)態(tài)后，從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)并釋放熒光光子所需的平均時間。它是熒光現(xiàn)象的核心時間特性，反映了熒光分子與其周圍微環(huán)境的相互作用，具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價值。相較于穩(wěn)態(tài)熒光測量所獲取的、反映激發(fā)態(tài)粒子系綜平均行為的信號，熒光壽命測量則提供了激發(fā)態(tài)分子衰變動力學(xué)的直接信息。前者主要指示特定光物理過程或化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生，而后者通過解析激子態(tài)弛豫的速率常數(shù)，能夠深入揭示導(dǎo)致該過程發(fā)生的具體物理機(jī)制。

穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜應(yīng)用

1.材料科學(xué)

在半導(dǎo)體材料的發(fā)光特性測量應(yīng)用中通常用激光激發(fā)材料產(chǎn)生熒光，利用熒光光譜分析材料的光學(xué)特性，單層MoS?因直接帶隙特性熒光Z強(qiáng)，隨層數(shù)增加轉(zhuǎn)變?yōu)殚g接帶隙導(dǎo)致熒光驟減，即可從PL譜可判斷MOS2層數(shù)。（參考文獻(xiàn)：Krishna et al., Nanoscale, 2014, 6, 13028–13035；）

圖2 熒光光譜與成像對MOS2薄膜的定性分析

關(guān)于真空沉積CH?NH?PbI?（eMAPI）鈣鈦礦薄膜的研究中，穩(wěn)態(tài)熒光和瞬態(tài)熒光譜技術(shù)扮演了互補(bǔ)且關(guān)鍵的角色。共同揭示了真空沉積鈣鈦礦薄膜（eMAPI）中光物理特性與器件性能之間的內(nèi)在聯(lián)系。圖3. (A)穩(wěn)態(tài)測量結(jié)果表明，基于eMAPI的太陽能電池實(shí)現(xiàn)了高達(dá)20.6%的轉(zhuǎn)換效率和1.16 V的開路電壓，證明了其優(yōu)異的體相質(zhì)量，但這與常規(guī)認(rèn)知中長熒光壽命是高效率前提的觀點(diǎn)相矛盾，因?yàn)?/span>eMAPI的熒光壽命極短。圖3. (B)瞬態(tài)熒光技術(shù)作為核心分析手段，解決了這一矛盾。實(shí)驗(yàn)首先確認(rèn)了eMAPI的超短熒光壽命（僅約0.75 ns），隨后通過表面鈍化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈍化后壽命顯著延長至73.5 ns，這確鑿地證明了其短壽命并非源于體相非輻射復(fù)合，而是由薄膜表面的快速非輻射復(fù)合所主導(dǎo)。

（參考文獻(xiàn)：Jubok et al., J. Phys. Chem. Lett. 2019,10,5167-5172）

圖3 非鈍化與鈍化情況下，eMAPI玻璃層的瞬態(tài)熒光

襯底作為二維材料緊密接觸的支撐結(jié)構(gòu)，其鄰近摻雜效應(yīng)可顯著調(diào)控二維材料的光學(xué)特性。研究人員利用熒光壽命成像顯微鏡技術(shù)，說明鄰近摻雜效應(yīng)直接調(diào)控著MoS?中載流子的生成與復(fù)合動力學(xué)過程。具體而言，ITO襯底上的MoS?表現(xiàn)出顯著的載流子壽命和熒光壽命縮短。這是由于隨著載流子密度增加，材料中的缺陷捕獲電荷的可能性增加，被捕獲的載流子能保持更長的時間，減少它們對電荷傳輸?shù)呢暙I(xiàn)并增加復(fù)合的可能性，進(jìn)而使載流子壽命縮短。穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光的檢測表征技術(shù)揭示了襯底對二維材料光電性質(zhì)的調(diào)控機(jī)理，為未來設(shè)計和優(yōu)化高性能二維材料光電器件開辟了新途徑，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。（參考文獻(xiàn)： Loc et al., Laser & Photonics Reviews.2025.e00682）

圖4 單層MoS2在不同襯底上的 (a) 熒光特性 (b) 熒光壽命成像實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.生物醫(yī)學(xué)

熒光光譜對疾病的早期預(yù)防和診斷具有無損檢測的監(jiān)測優(yōu)勢。通過熒光光譜對宮頸癌病變前后的樣本進(jìn)行檢測，其光譜的高靈敏度可反映細(xì)胞代謝異常，能發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)病理難以檢測的微小病變（參考文獻(xiàn)：Jeong et al., Journal of Biophotonics 2018;11(5):e201700245）

圖5. 一個癌前病變CINIII的患者，兩個不同部位的切片組織形態(tài)表現(xiàn)出差異，A為尚未病變，B為病變。C和D展現(xiàn)出一致的光譜特性

此外，瞬態(tài)熒光光譜及其熒光壽命成像對腫瘤細(xì)胞的的診斷也提供了依據(jù)，作為一種快速、靈敏且微創(chuàng)的輔助診斷手段通常會和內(nèi)窺鏡等醫(yī)療器械共同作用，凸顯出穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)熒光光譜的應(yīng)用潛力。

圖6. 肺癌患者腫瘤交界區(qū)域的熒光壽命顯微成像

3.藥代動力學(xué)

基于穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜，以高發(fā)光性的CA/EDA-CDs作為探針，對·OH具有選擇性的熒光響應(yīng)。通過熒光檢測手段，實(shí)現(xiàn)了對氨茶堿（一種基于黃嘌呤的支氣管擴(kuò)張劑）的監(jiān)測，CA/EDA-CDs 顯示出高量子產(chǎn)率（56.56%），且其發(fā)射峰在450 nm處保持穩(wěn)定，表明其具有激發(fā)獨(dú)立性及其作為探針的優(yōu)勢，使用瞬態(tài)熒光光譜儀記錄CA/EDA-CDs的壽命衰減，露于·OH后，引入破壞了共軛系統(tǒng)，平均熒光壽命從15.11 ns降至12.08 ns，表明·OH誘導(dǎo)了非輻射能量耗散。TCSPC則量化了這一過程對激發(fā)態(tài)動力學(xué)的動態(tài)影響。（參考文獻(xiàn)：Yif et al., Materials Today Bio 33:102019）

圖7. （A）探針及Fe-XOD酶催化系統(tǒng)檢測氨茶堿（AMP）的可行性分析。（B）電子順磁共振（ESR）。（C）紫外-可見吸收光譜。（D）CA/EDA-CDs的熒光發(fā)射過程示意圖及由Fe²?+XOD催化AMP產(chǎn)生的·OH引起的CA/EDA-CDs能帶結(jié)構(gòu)變化及熒光猝滅機(jī)理。(E)CA/EDA-CDs, CA/EDA-CDs+AMP, CA/EDA-CDs+XOD, CA/EDA-CDs+Fe²?+XOD和CA/EDA-CDs+Fe²?+XOD+ AMP的熒光壽命衰減曲線。

4.熒光探針

瞬態(tài)與穩(wěn)態(tài)熒光光譜技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用為熒光探針的開發(fā)和優(yōu)化提供了多維度、深層次的分析手段。在該研究中，通過穩(wěn)態(tài)和瞬態(tài)熒光光譜技術(shù)研究了8-甲氧基-3-羧乙基香豆素（8EMOHCC）在不同溶劑中被苯胺猝滅的熒光行為。穩(wěn)態(tài)熒光測量如圖8.（B）所示，隨著苯胺濃度增加，8EMOHCC的熒光強(qiáng)度顯著降低，但光譜形狀和峰值未發(fā)生位移，表明無激基復(fù)合物形成。穩(wěn)態(tài)S-V曲線在所有溶劑中均呈線性，符合動態(tài)猝滅特征，且猝滅常數(shù)KSV隨溶劑介電常數(shù)增大呈非線性增加，表明溶劑極性通過調(diào)控電荷轉(zhuǎn)移過程影響猝滅效率。

瞬態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)如圖8.（C）所示，通過時間相關(guān)單光子計數(shù)技術(shù)記錄了熒光壽命衰減曲線，發(fā)現(xiàn)衰減呈單指數(shù)形式，證明猝滅過程均勻。瞬態(tài)S-V曲線同樣呈線性，進(jìn)一步確認(rèn)猝滅為動態(tài)主導(dǎo)。通過多溶劑體系下的穩(wěn)態(tài)與瞬態(tài)熒光聯(lián)用，明確了8EMOHCC的猝滅機(jī)制為擴(kuò)散與激活協(xié)同的動態(tài)過程，并揭示了溶劑介電常數(shù)的關(guān)鍵作用。該方法與結(jié)論對熒光探針設(shè)計、生物分子相互作用研究及光物理機(jī)制探索具有重要參考價值。（參考文獻(xiàn)：Keerthana et al., J Fluoresc (2021) 31:393–400）

圖8. （A）8EMOHCC分子結(jié)構(gòu)。（B）8EMOHCC在丙醇溶劑中不同濃度苯胺的典型熒光光譜。（C）8EMOHCC與不同濃度苯胺在丙醇溶劑中的熒光衰減光譜。

5.環(huán)境監(jiān)測

在復(fù)雜的環(huán)境基質(zhì)中，多種污染物的共存對生態(tài)系統(tǒng)和公眾健康構(gòu)成重大威脅，通過熒光特征峰可以快速且靈敏的對目標(biāo)污染物進(jìn)行篩選，通過使用賴氨酸銅納米團(tuán)簇、半胱氨酸銅納米團(tuán)簇和氨基酸銅納米團(tuán)簇三種具有獨(dú)特配體結(jié)合親和力的銅納米團(tuán)簇（Cu NCs），與機(jī)器學(xué)習(xí)算法結(jié)合，可以區(qū)分多種重金屬離子和農(nóng)藥。（參考文獻(xiàn)：Varghese et al., Biosensors and Bioelectronics,2025,287(117706)）

圖9. 三種銅納米簇及其熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜

6.食品安全

在食品科學(xué)中，熒光光譜技術(shù)作為一種快速、無損的分析工具，被系統(tǒng)應(yīng)用于監(jiān)測食物中化學(xué)成分變化。如圖10所示，通過同步掃描和定點(diǎn)激發(fā)獲取了牛奶在酸化過程中不同時間點(diǎn)的光譜數(shù)據(jù)，通過光譜變化解析牛奶酸化過程中的化學(xué)成分變化，再建立熒光指標(biāo)與酸度的線性模型，實(shí)現(xiàn)酸化程度的準(zhǔn)確預(yù)測，為開發(fā)實(shí)時監(jiān)測設(shè)備提供理論基礎(chǔ)，助力乳品行業(yè)的質(zhì)量控制與優(yōu)化。（參考文獻(xiàn)：Sudhakar et al., Agriculture 2023, 13, 1054）

圖10. 牛奶在光致發(fā)光激發(fā)下的熒光光譜特性

熒光光譜被用作核心分析手段，用于探究特級初榨橄欖油（EVOO）在激光誘導(dǎo)下的熒光特性及其摻假識別問題。研究采用405 nm連續(xù)波（CW）二極管激光作為激發(fā)光源，系統(tǒng)測量了EVOO及其摻假樣本（如摻入葵花籽油SO）在不同探測角度下的熒光光譜。通過分析熒光光譜的強(qiáng)度分布和譜形變化，研究者識別出EVOO中主要熒光團(tuán)（如葉綠素衍生物、類胡蘿卜素和維生素E）的貢獻(xiàn)。（參考文獻(xiàn)：Duong et al., Microchemical Journal 214 (2025) 114023）

圖11. （A）摻假橄欖油（B）特級初榨橄欖油樣品在405 nm激光激發(fā)下的熒光光譜以及在不同檢測角度下檢測到的光譜及其分析