近紅外熒光成像顯微鏡應(yīng)用

近紅外熒光共聚焦顯微成像系統(tǒng)

在生物醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)、光電子器件及生物醫(yī)藥工程等科學(xué)研究領(lǐng)域，目標(biāo)樣品（如活體小動(dòng)物深層組織、NIR-II 量子點(diǎn) / 鈣鈦礦微納結(jié)構(gòu)、生物靶向熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞）常呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)演化、多結(jié)構(gòu)層級(jí)且受環(huán)境敏感的復(fù)雜特征，其核心性能（如組織成像深度、材料發(fā)光均勻性、探針靶向效率）與空間分布、時(shí)間動(dòng)態(tài)及光 - 物質(zhì)相互作用緊密綁定。傳統(tǒng)單一成像技術(shù)僅能從單維度獲取信息，難以突破 “淺層成像局限” 與 “高背景干擾” 的雙重瓶頸，無(wú)法全面解析 NIR-II 波段有的深層、高分辨成像需求。而近紅外二區(qū)熒光共聚焦顯微成像系統(tǒng)通過(guò)整合 NIR-II 波段優(yōu)勢(shì)、共聚焦空間分辨能力與原位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)功能，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品從亞微米微觀結(jié)構(gòu)到數(shù)毫米深層組織的全方成像解析，已成為突破 NIR-II 相關(guān)復(fù)雜體系研究瓶頸的核心技術(shù)。

任何非 NIR-II 波段的成像技術(shù)或非共聚焦模式，都存在深層成像能力與空間分辨率的固有局限，僅能反映樣品的部分屬性，無(wú)法完整捕捉 NIR-II 領(lǐng)域的核心研究需求。例如，可見(jiàn)光共聚焦成像雖具備亞微米空間分辨率，卻因生物組織對(duì)可見(jiàn)光的強(qiáng)散射與吸收，穿透深度僅數(shù)百微米，難以覆蓋小鼠腦部、肝臟等深層組織；NIR-I 熒光成像（700-900 nm）雖穿透深度略有提升，但仍受限于組織泛頻吸收，背景噪聲顯著，無(wú)法清晰區(qū)分腫瘤邊界與正常組織；普通寬場(chǎng) NIR-II 成像雖能利用 “生物光學(xué)窗口”（1000-1700 nm）實(shí)現(xiàn)數(shù)毫米穿透，卻缺乏共聚焦的空間層析能力，無(wú)法定位深層組織中的亞微米結(jié)構(gòu)（如毛細(xì)血管分支）；瞬態(tài)熒光成像雖能捕捉發(fā)光動(dòng)力學(xué)，卻無(wú)法關(guān)聯(lián) NIR-II 波段有的深層空間分布 —— 這就需要借助近紅外二區(qū)熒光共聚焦顯微成像系統(tǒng)，通過(guò) “NIR-II 波段低散射 + 共聚焦高分辨” 的協(xié)同優(yōu)勢(shì)，填補(bǔ)深層、高分辨成像的關(guān)鍵空白，Z大化與其他技術(shù)的互補(bǔ)性。（參考文獻(xiàn)：Schmidt et al., Nat Rev Methods Primers 4, 23 (2024).）

圖1. 近紅外二區(qū)熒光成像

在光學(xué)信息探測(cè)領(lǐng)域，近紅外二區(qū)熒光共聚焦顯微成像系統(tǒng)常集成原位環(huán)境調(diào)控（溫度、濕度、氣體氛圍，適配活體生物樣品）與多模態(tài)數(shù)據(jù)關(guān)聯(lián)（同步采集熒光強(qiáng)度、空間層析圖像、時(shí)間分辨發(fā)光信號(hào)）功能，通過(guò)高數(shù)值孔徑 NIR-II 專用物鏡聚焦激發(fā)光、針孔過(guò)濾背景雜光，確保在統(tǒng)一空間 - 深度坐標(biāo)系下同步獲取樣品的三維熒光分布與動(dòng)態(tài)演化數(shù)據(jù)，有效規(guī)避了傳統(tǒng)分步檢測(cè)中 “樣品位移導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)錯(cuò)位”“環(huán)境變化引發(fā)的熒光淬滅” 等問(wèn)題。由于生物組織對(duì) NIR-II 光的散射與吸收僅為可見(jiàn)光的 1/10-1/5，且該系統(tǒng)具備低光毒性（減少組織光損傷），可實(shí)時(shí)解析 “光 - NIR-II 探針 - 生物組織” 的跨維度相互作用機(jī)制 —— 例如，在活體小鼠腦部成像中，能清晰呈現(xiàn)數(shù)毫米深度下的毛細(xì)血管管徑、血流速度分布；在 NIR-II 量子點(diǎn)微納結(jié)構(gòu)表征中，可定位亞微米級(jí)區(qū)域的發(fā)光缺陷。這種原位融合策略不僅為 NIR-II 微納材料的界面發(fā)光機(jī)制、生物組織的生理功能（如腫瘤血管新生）等微觀機(jī)理研究提供了直接證據(jù)，還通過(guò) “動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè) + 深層層析” 技術(shù)的結(jié)合，為揭示復(fù)雜體系（如腫瘤微環(huán)境與探針相互作用）的跨尺度作用規(guī)律奠定了核心方法學(xué)基礎(chǔ)。

近紅外二區(qū)熒光共聚焦顯微成像系統(tǒng)的核心價(jià)值，不僅在于 “NIR-II 波段優(yōu)勢(shì) + 共聚焦分辨能力” 的協(xié)同應(yīng)用，更在于其產(chǎn)生的 “空間 - 深度 - 時(shí)間” 多維度成像數(shù)據(jù)的深度耦合與智能解析。這種融合突破了傳統(tǒng)成像技術(shù) “淺層局限”“分辨率 - 穿透深度權(quán)衡” 的 “數(shù)據(jù)孤島” 問(wèn)題，通過(guò)建立 “樣品空間分布 - 深層組織響應(yīng) - 時(shí)間動(dòng)態(tài)演化” 的跨尺度關(guān)聯(lián)模型，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系的全息化認(rèn)知 —— 例如，在腫瘤診斷中，可同時(shí)獲取腫瘤邊界的空間位置、深層血管的供血狀態(tài)及探針的靶向結(jié)合效率；在 NIR-II 材料表征中，能關(guān)聯(lián)微區(qū)發(fā)光強(qiáng)度與晶體結(jié)構(gòu)的均勻性。尤其在當(dāng)前人工智能與深度學(xué)習(xí)快速發(fā)展的背景下，該系統(tǒng)產(chǎn)生的大通量成像數(shù)據(jù)（如活體組織三維熒光圖譜、材料微區(qū)發(fā)光動(dòng)態(tài)曲線）與深度學(xué)習(xí)算法結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)腫瘤區(qū)域自動(dòng)識(shí)別、血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)定量分析、NIR-II 材料缺陷智能定位，必將突破現(xiàn)有 “經(jīng)驗(yàn)驅(qū)動(dòng)” 的成像與表征范式，邁入以數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的 NIR-II 科學(xué)研究新階段。

應(yīng)用案例：

1. 時(shí)間-空間-能量多維度解析生物組織深層動(dòng)態(tài)與分子機(jī)制

將近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-3000 nm）波段低組織散射、低自體熒光的固有優(yōu)勢(shì)與時(shí)間分辨光譜及實(shí)空間（r-space）成像相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)生物組織中 NIR-II 熒光探針在不同時(shí)間延遲、不同空間位置、不同能量（波長(zhǎng)）下的發(fā)射特性的系統(tǒng)性分析，從而深入揭示探針信號(hào)與生物過(guò)程的依賴關(guān)系。近紅外二區(qū)熒光成像的核心思想是將 “時(shí)間延遲” 與 “探針類型 / 激發(fā)參數(shù)” 作為關(guān)鍵變量，通過(guò) InGaAs 探測(cè)器介導(dǎo)的寬場(chǎng) / 共聚焦 / 光片成像系統(tǒng)與電子門(mén)控時(shí)間分辨技術(shù)，精確測(cè)量不同條件下三類 NIR-II 探針（無(wú)機(jī)納米顆粒、有機(jī)分子、基因工程蛋白）的發(fā)光強(qiáng)度、發(fā)射波長(zhǎng)與空間分布差異，構(gòu)建探針信號(hào)在時(shí)間 - 空間（t-r 空間）中的動(dòng)態(tài)分布圖譜。相比傳統(tǒng)可見(jiàn)光 / NIR-I 成像（僅關(guān)注淺層靜態(tài)結(jié)構(gòu)與宏觀光強(qiáng)），NIR-II 熒光成像不僅能提供探針的動(dòng)態(tài)演化（如血流速度、藥物清除軌跡）與深層空間定位信息，還能反映生物組織內(nèi)部光誘導(dǎo)的散射規(guī)律、探針與生物靶點(diǎn)的結(jié)合效率，以及自體熒光抑制對(duì)信號(hào)信噪比（SNR）的提升作用。（參考文獻(xiàn)：Nat Rev Methods Primers 4, 23 (2024).）

圖2. 腫瘤中CD8+ T細(xì)胞（紅色）、卵白蛋白抗原特異性T細(xì)胞（綠色）和pernp - ovacase -B胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤（CpG B）納米疫苗（藍(lán)色）的三維（3D）重建NIR-II圖像[1]

更進(jìn)一步，若在時(shí)間分辨與空間成像的基礎(chǔ)上引入能量軸（E，即探針發(fā)射波長(zhǎng)），則可以在由時(shí)間延遲（t）、空間位置（r）與光子能量（E）組成的三維空間（t-r-E 相空間）中繪制探針信號(hào)的發(fā)射分布圖，即 I (t,r,E) 圖譜。這類圖譜允許研究人員同時(shí)追蹤探針的時(shí)間演化規(guī)律（如血流前沿移動(dòng)、淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)效）、空間分布特征（如腫瘤靶向聚集區(qū)域、深層血管分支）與能量適配特性（如發(fā)射波長(zhǎng)與 NIR-II 亞區(qū)的匹配度），揭示不同探針 - 生物相互作用狀態(tài)下信號(hào)發(fā)射的選擇性起源。例如，在活體生物組織成像中，不同時(shí)間、空間與能量下的 NIR-II 探針信號(hào)呈現(xiàn)顯著差異：FDA 批準(zhǔn)的 ICG 憑借尾發(fā)射延伸至 NIR-IIa 區(qū)（1300-1400 nm），在人類肝腫瘤手術(shù)中可實(shí)時(shí)定位亞毫米級(jí)轉(zhuǎn)移灶（空間分辨率～2 μm），時(shí)間維度上能追蹤術(shù)后 24 小時(shí)內(nèi)探針的肝腎清除動(dòng)態(tài)；NaYbF?:Er 稀土納米顆粒（RENPs）發(fā)射 1550 nm NIR-IIb 波段信號(hào)，穿透小鼠完整顱骨后仍保持 SNR>10，空間上清晰區(qū)分腦部動(dòng)脈（紅色）與靜脈（藍(lán)色）分支，能量上匹配組織散射最小化窗口，時(shí)間上通過(guò) > 20 幀 / 秒的動(dòng)態(tài)成像捕捉心臟周期引發(fā)的血流波動(dòng)；CH-4T@蛋白復(fù)合物發(fā)射 1000 nm NIR-II 信號(hào)，在淋巴成像中可與血管探針（DCNPs，1060 nm）形成雙色成像，空間上精準(zhǔn)區(qū)分腹股溝淋巴結(jié)與周圍血管網(wǎng)絡(luò)，時(shí)間上追蹤探針從皮內(nèi)注射到淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程（~30 分鐘達(dá)峰）；NIR-II 熒光成像可用于判定 RENPs 為 “深層腦組織成像優(yōu)先探針”（適配 NIR-IIb 低散射窗口），ICG 為 “臨床轉(zhuǎn)化優(yōu)先探針”（FDA 批準(zhǔn)屬性），同時(shí)識(shí)別組織自體熒光隨波長(zhǎng)增加的衰減規(guī)律（>1300 nm 可忽略）引發(fā)的 SNR 提升效應(yīng)。

2. 量子點(diǎn)探針的制備與 NIR-II 深層生物成像應(yīng)用

近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700 nm）熒光成像憑借低組織散射、低自體熒光的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在深層組織高分辨率成像領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，成為生物醫(yī)學(xué)成像的重要研究方向。然而，現(xiàn)有 NIR-II 熒光團(tuán)（如有機(jī)染料、碳納米管、稀土納米晶）普遍存在量子產(chǎn)率低、化學(xué)穩(wěn)定性差或生物相容性不足的問(wèn)題；雖 PbS 量子點(diǎn)（QDs）具有高量子產(chǎn)率（可達(dá) 60%），但其重金屬（Pb²?）泄漏毒性、S²?易氧化導(dǎo)致的光學(xué)穩(wěn)定性缺陷，嚴(yán)重限制了其在活體成像中的應(yīng)用。近年來(lái)，PbS@CdS 核殼結(jié)構(gòu) QDs 通過(guò) CdS 殼層初步改善了 Pb²?泄漏問(wèn)題，而 SiO?與 FDA 批準(zhǔn)的兩親性聚合物 Pluronic F-127 的雙層包覆策略，可進(jìn)一步協(xié)同提升材料的化學(xué)穩(wěn)定性與生物相容性 ——SiO?層提供物理隔絕以抑制氧化和離子泄漏，F-127 層賦予水溶性與抗生物吸附能力，通過(guò)構(gòu)建 PbS@CdS@SiO?@F-127 納米顆粒（NPs），有望突破 NIR-II 熒光探針 “高亮度 - 高穩(wěn)定 - 低毒性” 難以兼顧的瓶頸，為腦血管、胃腸道等深層組織成像提供新方案。

在該研究中，采用反相微乳液法、表面嫁接改性及超聲分散工藝制備目標(biāo)量子點(diǎn)，并結(jié)合透射電子顯微鏡（TEM）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、穩(wěn)態(tài) / 瞬態(tài)熒光光譜、原子吸收光譜（AAS）及 InGaAs 相機(jī)成像系統(tǒng)，系統(tǒng)揭示了 PbS@CdS@SiO?@F-127 NPs 的本征光學(xué)特性、化學(xué)穩(wěn)定性及生物成像性能，發(fā)現(xiàn)其具有高量子產(chǎn)率（~5.79%，遠(yuǎn)超多數(shù)現(xiàn)有 NIR-II 熒光團(tuán)）、寬 pH 范圍化學(xué)穩(wěn)定性（pH 1-13 內(nèi) 24 h 熒光變化 <30%）、低體內(nèi)外毒性（UMUC3 細(xì)胞 10 μg/mL 濃度下存活率> 90%），以及超快體內(nèi)清除（胃腸道灌胃后 4.5 h 隨糞便排出）等優(yōu)勢(shì)；這些性能提升歸因于 SiO?-F-127 雙層結(jié)構(gòu)的協(xié)同作用 ——SiO?殼層物理隔絕氧氣與水以抑制 QDs 氧化，F-127 的 PEG 鏈段降低蛋白吸附并提升水溶性，而兩者形成的致密包覆層有效阻斷 Pb²?/Cd²?泄漏，同時(shí) n 型 QDs 與包覆層間的界面相互作用優(yōu)化了熒光發(fā)射特性。（參考文獻(xiàn)：Zebibula et al., Adv. Funct. Mater., 32: 2200386 (2022)）

圖3. 同一小鼠腦血管在不同深度拍攝的 NIR-II 熒光圖像

實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效確認(rèn)了單層 CdS 殼層對(duì) PbS 核的保護(hù)作用（降低 Pb²?泄漏率）和 SiO?-F-127 雙層包覆對(duì)化學(xué)穩(wěn)定性的提升效果，凸顯了 PbS@CdS@SiO?@F-127 NPs  NIR-II 成像性能：其發(fā)射峰位于 1155 nm（適配 NIR-IIa 低散射窗口），在小鼠腦血管成像中實(shí)現(xiàn) 950 μm 深度的血管網(wǎng)絡(luò)清晰可視化，3D 重建圖像可分辨軟腦膜毛細(xì)血管；在胃腸道成像中，以 80 μg/kg 的低劑量灌胃，即可實(shí)現(xiàn) 3-5 mm 深度的消化器官動(dòng)態(tài)追蹤（10 min 顯胃輪廓、4.5 h 達(dá)大腸并隨糞便排出），7 d 后體內(nèi)無(wú)殘留。同時(shí)，這些結(jié)果也直接指導(dǎo)了探針的實(shí)驗(yàn)參數(shù)選擇：激發(fā)波長(zhǎng)確定為 785 nm（匹配 PbS@CdS QDs 的高激發(fā)效率），成像檢測(cè)窗口鎖定 1100-1700 nm（濾除激發(fā)光雜散光）；其中，不同 pH 條件下的熒光強(qiáng)度變化圖譜為雙層包覆的化學(xué)穩(wěn)定性提供了直接光學(xué)證據(jù)，而活體成像中的熒光信號(hào)動(dòng)態(tài)演化（如腦血管血流波動(dòng)、胃腸道探針遷移軌跡），則進(jìn)一步驗(yàn)證了該量子點(diǎn)在深層組織動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中的可靠性。

3. 生物相容水溶性短波紅外（SWIR）發(fā)射花菁類熒光探針的合成與活體乳腺癌多維度分子成像應(yīng)用

短波紅外（SWIR，900-1400 nm）成像憑借低組織散射、低自體熒光的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在深層組織生物分子可視化領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力，尤其為乳腺癌等實(shí)體瘤的精準(zhǔn)成像提供了新方向。然而，當(dāng)前臨床及科研中可用的 SWIR 熒光探針存在顯著局限：經(jīng) FDA 批準(zhǔn)的近紅外（NIR）探針吲哚菁綠（ICG），雖可延伸至 SWIR 波段發(fā)射，但激發(fā)波長(zhǎng)限于 800 nm 以下，僅支持單色成像，無(wú)法滿足多靶點(diǎn)同步監(jiān)測(cè)需求；其他 SWIR 熒光團(tuán)（如碳納米管、量子點(diǎn)）則面臨生物相容性差、水溶性不足或合成復(fù)雜的問(wèn)題。近年來(lái)，基于 ICG 的 π- 共軛擴(kuò)展花菁類染料因結(jié)構(gòu)可調(diào)性強(qiáng)、生物安全性高備受關(guān)注，其中 ICG-C9 與 ICG-C11 通過(guò)增加多甲川鏈雙鍵數(shù)量（分別比 ICG 多 1 個(gè)、2 個(gè)雙鍵），實(shí)現(xiàn)發(fā)射波長(zhǎng)紅移至 SWIR 核心波段，且依托 ICG 母核的生物相容性基礎(chǔ)，可通過(guò)表面修飾實(shí)現(xiàn)水溶性優(yōu)化。通過(guò)構(gòu)建 ICG/ICG-C9/ICG-C11 基探針與抗體、凋亡標(biāo)志物或抗癌藥物的偶聯(lián)物，能夠協(xié)同 SWIR 成像優(yōu)勢(shì)與靶向識(shí)別能力，實(shí)現(xiàn)乳腺癌表面受體、腫瘤血管及凋亡過(guò)程的多維度解析，為 SWIR 分子成像的臨床轉(zhuǎn)化提供新思路。（參考文獻(xiàn)：Mahadeva et al., ACS Appl. Mater. Interfaces.,16, 17253−17266(2024).）

圖4. 吲哚菁綠（ICG）、ICG-C9 與 ICG-C11 的光學(xué)特性綜合表征包含吸收光譜、熒光光譜、熒光發(fā)射峰值與量子產(chǎn)率和熒光發(fā)射壽命

在該研究中，采用有機(jī)合成、穩(wěn)態(tài) / 瞬態(tài)光譜表征及活體成像技術(shù)，系統(tǒng)揭示了 ICG-C9/ICG-C11 探針的本征光學(xué)特性與生物成像性能，發(fā)現(xiàn)其具有精準(zhǔn) SWIR 波段發(fā)射（水相 1% BSA 中，ICG-C9 發(fā)射 922 nm、ICG-C11 發(fā)射 1010 nm）、優(yōu)異生物相容性（HeLa 細(xì)胞 10 μM 濃度下存活率 > 90%，體內(nèi) 4 周肝腎功能指標(biāo)正常）及穩(wěn)定成像能力（1% BSA 中激光照射 60 min 光漂白率 < 30%），這些性能提升歸因于 π- 共軛擴(kuò)展帶來(lái)的波長(zhǎng)紅移效應(yīng)、BSA 與探針的復(fù)合作用增強(qiáng)穩(wěn)定性，以及花菁母核繼承的 ICG 生物安全性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效確認(rèn)了 ICG-C9/ICG-C11 的 π- 共軛擴(kuò)展結(jié)構(gòu)與 SWIR 發(fā)射特性的關(guān)聯(lián)（每增加 1 個(gè)雙鍵，發(fā)射波長(zhǎng)紅移～100 nm），以及 NHS 酯、馬來(lái)酰亞胺、炔烴三類標(biāo)記試劑與抗體（Herceptin、Erbitux）、annexin V、抗癌藥物 Kadcyla 的高效偶聯(lián)能力，凸顯了該類探針多色 SWIR 成像適應(yīng)性 —— 通過(guò) 785 nm（ICG）、905 nm（ICG-C9）、975 nm（ICG-C11）差異化激發(fā)與對(duì)應(yīng)波段濾光片（900±25 nm、1000±25 nm、1100±25 nm），可實(shí)現(xiàn)乳腺癌 HER2/EGFR 受體與腫瘤血管的三色同步成像；同時(shí)，該結(jié)果也直接指導(dǎo)了凋亡成像的探針組合選擇（ICG-Kadcyla 與 ICG-C9/IC11-annexin V）及長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)的波長(zhǎng)參數(shù)（ICG-C9-Kadcyla 采用 905 nm 激發(fā)、>1000 nm 探測(cè)）。其中，穩(wěn)態(tài)吸收 / 熒光光譜證實(shí)了探針 - 生物分子偶聯(lián)后的光學(xué)特性保留，瞬態(tài)熒光 decay 曲線（ICG-C9 壽命 2.7 ns、ICG-C11 壽命 7.1 ns）為 SWIR 信號(hào)的時(shí)間分辨識(shí)別提供了必要光學(xué)證據(jù)，而活體成像的信號(hào)分布則驗(yàn)證了探針的靶向性。