PCR基因擴增儀是分子生物學(xué)實驗中用于體外擴增特定DNA片段的核心設(shè)備。其操作需嚴格規(guī)范以保證結(jié)果的準確性和重復(fù)性。PCR實驗的核心是通過溫度循環(huán)(變性、退火、延伸)實現(xiàn)DNA的指數(shù)級擴增，具體步驟可分為實驗前準備、上機運行和結(jié)果分析三部分。
1.實驗前準備
-模板DNA提取與定量：
從樣本(如細胞、組織、血液等)中提取基因組DNA或RNA(若為RT-PCR需先反轉(zhuǎn)錄為cDNA)。提取后通過分光光度計(A260/A280比值)或熒光定量法(如Qubit)檢測DNA濃度與純度，確保模板質(zhì)量(無降解、無抑制物)。
-引物設(shè)計合成：
根據(jù)目標基因序列設(shè)計特異性引物(長度18-25bp，GC含量40-60，避免二級結(jié)構(gòu))，并通過BLAST驗證特異性。引物需用無菌TE緩沖液溶解至工作濃度(通常10μM/L)。
-加樣與防污染：
將反應(yīng)液分裝至PCR管(或八連排管)，蓋緊管蓋(避免蒸發(fā))。操作需在生物安全柜或超凈臺中進行，使用帶濾芯槍頭，防止氣溶膠污染(尤其是陽性對照或高拷貝模板)。
2.上機運行程序
根據(jù)擴增目標(片段長度、引物特性)設(shè)置溫度循環(huán)參數(shù)，典型程序如下：
-預(yù)變性：94-98℃(常用95℃)，2-5分鐘(使DNA解鏈，激活熱啟動酶)。
-循環(huán)階段(25-40次)：
-變性：94-98℃，15-30秒(破壞雙鏈DNA)；
-退火：50-65℃(根據(jù)引物Tm值計算，通常Tm-5℃)，15-30秒(引物結(jié)合模板)；
-延伸：72℃，時間按片段長度調(diào)整(1kb/分鐘，不超過5分鐘)。
-終延伸：72℃，5-10分鐘(確保所有片段延伸)。
-保存：4℃(短期保存)或終止程序(長期保存)。
3.結(jié)果分析
-電泳檢測：取5-10μL擴增產(chǎn)物，用1-2瓊脂糖凝膠電泳(電壓100-150V，20-30分鐘)，紫外燈下觀察目標條帶(與Marker對比判斷大小)。
-實時熒光定量PCR(qPCR)：若使用熒光染料(如SYBRGreen)或探針(如TaqMan)，可通過儀器自帶軟件分析擴增曲線、熔解曲線(驗證特異性)及Ct值(定量模板初始濃度)。
PCR基因擴增儀的優(yōu)點：
1.高效性：傳統(tǒng)方法數(shù)天的工作可在幾小時內(nèi)完成，提升研究效率。
2.高靈敏度：能將極微量DNA(如單個拷貝)擴增至可檢測水平，適用于痕量樣本分析。
3.強特異性：通過引物設(shè)計準確靶向目標序列，減少非特異性擴增。
4.操作簡便：自動化程序控制取代復(fù)雜手工操作，降低技術(shù)門檻。
5.應(yīng)用廣泛：從基礎(chǔ)科研到臨床診斷(如傳染病檢測)、法醫(yī)學(xué)鑒定等領(lǐng)域均有重要價值。
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