無縫克隆試劑盒基于同源重組原理，通過插入片段與線性化載體末端的同源序列(15-25 bp)實(shí)現(xiàn)定向重組，無需酶切與連接步驟，具有操作便捷、陽性率高(可達(dá)95%以上)、支持多片段重組等優(yōu)勢(shì)。
無縫克隆試劑盒其使用流程可分為以下三個(gè)核心步驟：
一、線性化載體制備
酶切法
雙酶切：選擇載體中兩個(gè)不同的酶切位點(diǎn)，用限制性內(nèi)切酶消化載體，通過凝膠電泳分離并回收線性化載體。雙酶切可降低載體自連背景，提高陽性率。
單酶切：若無可選雙酶切位點(diǎn)，可采用單酶切，但需延長(zhǎng)酶切時(shí)間(2小時(shí)至過夜)并進(jìn)行脫磷處理(如CIP處理20分鐘)，以減少自連假陽性。
注意事項(xiàng)：酶切后需通過膠回收純化線性化載體，避免環(huán)狀質(zhì)粒殘留；若載體長(zhǎng)度超過10 kb，建議延長(zhǎng)酶切時(shí)間以確保線性化。
反向PCR法
在載體克隆位點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物，通過PCR擴(kuò)增獲取線性化載體片段。
關(guān)鍵點(diǎn)：使用高保真DNA聚合酶(如Phusion或Q5)擴(kuò)增，避免堿基突變；擴(kuò)增產(chǎn)物需通過膠回收純化，去除環(huán)狀模板質(zhì)粒。
二、插入片段制備
引物設(shè)計(jì)
在插入片段的正反向引物5’端引入與線性化載體末端一致的同源序列(15-25 bp)。
示例：
正向引物：5’-上游載體同源序列(15-25 bp)+插入片段特異性序列-3’
反向引物：5’-下游載體同源序列(15-25 bp)+插入片段特異性序列-3’
注意事項(xiàng)：
同源序列Tm值需≥48℃，可通過公式計(jì)算(A-T堿基對(duì)=2°C，G-C堿基對(duì)=4°C)。
若載體為粘性末端且3’端突出，引物設(shè)計(jì)需包含突出部分；若5’端突出，則可選擇性包含。
避免在同源序列中引入酶切位點(diǎn)，除非需保留重組后位點(diǎn)。
PCR擴(kuò)增
使用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增插入片段，擴(kuò)增產(chǎn)物需通過凝膠電泳分離并回收。
特殊情況處理：若擴(kuò)增模板為環(huán)狀質(zhì)粒，建議用Dpn I消化模板DNA，避免殘留質(zhì)粒干擾重組反應(yīng)。
三、重組反應(yīng)與轉(zhuǎn)化
重組反應(yīng)體系配制
推薦比例：
線性化載體用量(ng)= 0.02 × 載體堿基對(duì)數(shù)(如5 kb載體需100 ng)。
插入片段用量(ng)= 0.04 × 片段堿基對(duì)數(shù)(單片段)或 0.02 × 片段堿基對(duì)數(shù)(多片段)。
若插入片段長(zhǎng)度小于200 bp，需使用5倍載體用量。
反應(yīng)條件：將線性化載體、插入片段與2× Cloning Master Mix混合后，50℃孵育15-60分鐘(片段數(shù)量與長(zhǎng)度影響反應(yīng)時(shí)間，如2-3個(gè)片段反應(yīng)20分鐘，4-6個(gè)片段反應(yīng)60分鐘)。
轉(zhuǎn)化與篩選
熱激轉(zhuǎn)化：
取100 μL冰浴融化的感受態(tài)細(xì)胞(如DH5α)，加入5-10 μL重組產(chǎn)物，輕輕混勻后冰浴30分鐘。
42℃水浴熱激45-90秒，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中靜置2分鐘。
加入500 μL無抗生素LB培養(yǎng)基，37℃、200 rpm復(fù)蘇1小時(shí)。
涂布平板：取100-300 μL復(fù)蘇液均勻涂布于含相應(yīng)抗生素的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
陽性克隆鑒定：
菌落PCR：用槍頭挑取單菌落至10 μL無菌水中混勻，取1 μL為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(建議使用載體通用引物或特異性引物)。
酶切鑒定：提取質(zhì)粒后用相應(yīng)內(nèi)切酶酶切，電泳檢測(cè)片段大小。
測(cè)序驗(yàn)證：對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)插入片段序列正確性。
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