實(shí)時(shí)熒光定量PCR詳細(xì)介紹

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過熒光化學(xué)物質(zhì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的技術(shù)，可對(duì)特定核酸序列進(jìn)行定量分析。
 

　　一、檢測(cè)原理
 

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合了PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化。通過Ct值(擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。
 

　　二、熒光標(biāo)記物
 

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR常用的熒光標(biāo)記物包括熒光探針和熒光染料：
 

　　熒光探針：
 

　　TaqMan熒光探針：在探針的5'端設(shè)計(jì)有報(bào)告基團(tuán)，3'端設(shè)計(jì)有淬滅基團(tuán)。當(dāng)報(bào)告基團(tuán)接近淬滅基團(tuán)時(shí)，不會(huì)檢測(cè)到熒光信號(hào)。在PCR反應(yīng)時(shí)，寡核苷酸兩個(gè)基團(tuán)分離，即可檢測(cè)到熒光信號(hào)，并與PCR產(chǎn)物同步。新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變(SNP)。
 

　　分子信標(biāo)：一種在5'和3'末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。當(dāng)與核酸靶分子雜交后，構(gòu)象發(fā)生變化而發(fā)出熒光。
 

　　熒光染料：
 

　　SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBR熒光染料，該染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)出熒光信號(hào)，未摻入鏈中的SYBR染料分子不發(fā)出任何熒光信號(hào)。因此，PCR產(chǎn)物越多，熒光越強(qiáng)，熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步。SYBR Green法可以用于各種擴(kuò)增產(chǎn)物的定量，只要最后產(chǎn)物是雙鏈DNA，這既是其主要優(yōu)點(diǎn)，也是主要的缺陷，即不能區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物的特異性。
 

　　三、優(yōu)勢(shì)
 

　　與普通PCR相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有許多優(yōu)點(diǎn)：
 

　　定量準(zhǔn)確：克服了傳統(tǒng)的基于反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量的缺陷，避免了酶活性差異對(duì)定量結(jié)果的影響，使對(duì)原始模板的定量更準(zhǔn)確，而且結(jié)果重現(xiàn)性好，定量范圍寬。
 

　　操作簡(jiǎn)便：整個(gè)PCR過程可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且耗時(shí)短，操作方便，不易污染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在加樣后的過程完成閉管操作，不需要PCR后處理，使該技術(shù)更簡(jiǎn)單、更快速、操作更安全、假陽(yáng)性率更低，因此結(jié)果更可靠。
 

　　結(jié)果直觀：儀器在線式實(shí)時(shí)檢測(cè)，結(jié)果直觀，避免人為判斷的失誤，結(jié)果數(shù)據(jù)可長(zhǎng)期保存。
 

　　四、用途
 

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR可應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域：
 

　　病原體檢測(cè)：常用于病毒載量測(cè)定，如乙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等的定量分析。
 

　　基因表達(dá)分析：可比較不同組織或條件下特定基因的轉(zhuǎn)錄水平差異，研究基因表達(dá)的情況，即該基因在不同生理階段的變化趨勢(shì)。
 

　　遺傳病診斷：能檢測(cè)基因拷貝數(shù)變異，如脊髓性肌萎縮癥的SMN1基因缺失。
 

　　腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)：如乳腺癌HER2基因擴(kuò)增分析。
 

　　其他領(lǐng)域：還可用于轉(zhuǎn)基因成分鑒定、微生物群落定量、法醫(yī)學(xué)、群體生物學(xué)及免疫學(xué)研究等。